проу
Продукти
Комплект N-гликан HCP0031A Представено изображение
  • Комплект N-гликан HCP0031A

Комплект N-гликан


Каталожен номер: HCP0031A

Опаковка: 5T/24T/96T

Този документ предоставя информация относно общите грижи и употребата на комплекта N-гликан за бързо ензимно освобождаване и бързо етикетиране на N-гликани.

Описание на продукта

Данни за продукта

Описание на продукта

Този документ предоставя информация относно общите грижи и употребата на комплекта N-гликан за бързо ензимно освобождаване и бързо етикетиране на N-гликани.Този протокол е валидиран с помощта на моноклонални антитела и също е тестван за изпълнение за широк спектър от други N-свързани гликопротеини.Препоръчваме на потребителя да потвърди ензимното освобождаване за своята конкретна проба.


  • Предишен:
  • Следващия:

  • Компоненти

    N-Glycan Kit (24T)

    Модул

    Cкомпонент

    HCP0031A

     

    Модул за дегликозилиране

    HCP0031A-1

    IgG

    1,2 мг

    PNGase F

    45µL

    PNGase F буфер

    0,5 мл

    Повърхностно активно вещество

    1,2 мг*6

    Модул за етикетиране

    HCP0031A-2

    MS реагент на прах

    8,2 mg*3

    Безводен DMF

    1mL

    Модул за почистване

    HCP0031A-3

    Плака за елуиране (96 ямки)

    1 парче

    Буфер за елуиране

    5 мл* 1

    Разредител за проби

    5 мл* 1

     

    Модул за събиране на проби

    HCP0031A-4

    Ленти с 8 епруветки (200 μL)

    100 броя

    Ленти с 8 капачки

    100 броя

    Събирателна плоча (96 ямки)

    1 парче

    Тава за отпадъци

    1 парче

    протокол

    Потребителят трябва да подготви следните реагенти и устройства, преди да започнете (Една IgG проба като пример):

    (1) 0,85% Nacl, 100 uL;ацетонитрил (LC-MS клас);ултрачиста вода;

    (2)15/85=свръхчиста вода/разтвор на ацетонитрил (v/v), 2mL;1/9/90=мравчена киселина/ултрачиста вода/ацетонитрил (v/v), 20mL;50 mM амониев формиат,PH=4,4,500mL;

    (3) SPE вакуумна помпа;Процесор за отрицателно налягане или процесор за положително налягане с 96-ямкова плака;Нагревателен модул или метална вана (90 ℃ и 50 ℃);вихров миксер;пипета.

     

    Стъпка 1: Бързо дегликозилиране

    (1) Разредете IgG пробата с 0,85% Nacl, за да получите крайна концентрация на IgG при 2 mg/mL.

    (2) PNGase F буфер: разредете 1 флакон повърхностно активно вещество (1,2 mg/3,6 mg) с (24 μL/72 μL)) PNGase F буфер, разбъркайте и съхранявайте на стайна температура (този разтвор трябва да се приготви преди употреба).

    (3) Добавете 20 μL IgG разтвор към 200 μL реакционна епруветка, добавете 3 μL PNGase F буфер, пипетирайте нагоре и надолу, за да смесите и след това добавете 3,3 μL ултрачиста вода, аспирирайте и разпределете, за да смесите.

    (4) Добавете всички горепосочени разтвори към нагревателния модул при 90 ℃, 3 минути, денатурирайте го и след това го извадете от нагревателния модул и охладете за 3 минути при стайна температура.

    (5) Добавете 1,2 μL PNGase F, аспирирайте и разпределете за смесване, загрейте 50 ℃, 5 минути с нагревателен модул.Потребителят може да подготви реагент за етикетиране, докато чака.

    (6) Извадете го от нагревателния модул и след това охладете за 3 минути при стайна температура.

     

    Стъпка 2. Бързо маркиране на гликозиламини

    (1) Разтвор на етикетиращ реагент: разредете един флакон с етикетиращ реагент (8,2 mg/24,6 m) с безводен DMF (60,13 μL/180,4 μL), този разтвор трябва да се приготви преди употреба), аспирирайте и разпределете 5-10 пъти, за да се гарантира реагентът се разтваря напълно.

    (2) Добавете 6 μL разтвор на етикетиращ реагент към реакционната епруветка, аспирирайте и разпределете 5-10 пъти, за да осигурите смесване, и след това оставете реакцията на етикетиране да продължи при стайна температура

    температура за 5 минути.

    (3) Добавете 179 μL ацетонитрил, разбъркайте за следващата стъпка.

     

    Стъпка 3: Почистване на Означен с Glycosylaмини

    (1) Настройте процесор за отрицателно налягане или процесор за положително налягане и 96-ямкова плака за елуиране.

    (2) Кондиционирайте ямките: добавете 200 μL ултрачиста вода към елюиращата плоча, за да кондиционирате ямките, съберете отпадъците от тавата за отпадъци.

    (3) Уравновесете ямките: добавете 200 μL 15/85 разтвор на вода/ацетонитрил (v/v), за да уравновесите ямките, съберете отпадъците в тава за отпадъци.

    (4 ) Зареждане на проба: Заредете пробите, разредени с ацетонитрил, и съберете отпадъците чрез тава за отпадъци.

    (5) Измийте ямките с 600 μL 1/9/90 мравчена киселина/ултрачиста вода/ацетонитрил (обем/обем) два пъти и съберете отпадъците в тава за отпадъци.

    (6) Извадете тавата за отпадъци и я сменете с чиния за събиране.

    (7) Измийте клетката с 50 μL буфер за елуиране, елуирайте гликаните към плаката за събиране и повторете тази стъпка.

    (8) Добавете 200 μL разредител за проба, разбъркайте го.

    Стъпка 4. HILIC-FLR

    (1) Хроматографска колона: ACQUITY UPLC® Glycan BEH Amide, 130 Å, 1,7 μm, 2.1 x 150 mm (водна част #186004742).

    (2) Температура на колоната: 60 ​​°C

    (3) Течна фаза A: 50 mM разтвор на амониев формиат (препоръчва се клас LC-MS), pH=4,4.

    (4) Течна фаза B: 100% ацетонитрил (LC-MS клас епрепоръчително).

    (5) Скорост на потока: 0,4 mL/min;

    (6) Градиент:

    Време(мин)

    Скорост на потока (mL/min)

    %A

    %B

    Извивка

    0

    0,4

    25

    75

    6

    35

    0,4

    46

    54

    6

    36.5

    0,2

    100

    0

    6

    39.5

    0,2

    100

    0

    6

    43. 1

    0,2

    25

    75

    6

    47.6

    0,4

    25

    75

    6

    55

    0,4

    25

    75

    6

    (7) Дължини на вълната на FLR: EX 265/EM 425 nm

    (8) FLR честота на дискретизация: 2 Hz

    (9) Инжекционен обем: 10 μL

    Моля, имайте предвид, че параметрите по-горе, базирани на машината, оборудвана с “ACQUITY® RDa”LCMS, потребителят може да регулира съответно параметъра на друго оборудване.

     

    Sиздръжка

    реагент

    Съхранение

    IgG

    2-8 ℃, 12 месеца

    PNGase F

    -25 ~ – 15 ℃℃, 12 месеца, избягвайте

    цикли на замразяване/размразяване

    PNGase F буфер

    2-8 ℃, 12 месеца

    Повърхностно активно вещество

    Стайна температура, 12 месеца

    MS реагент на прах

    2-8 ℃, 12 месеца, съхранявайте на тъмно

    Безводен DMF

    Стайна температура, 12 месеца

    Буфер за елуиране

    Стайна температура, 12 месеца

    Разредител на пробата

    Стайна температура, 12 месеца

    Елуираща плака с 96 ямки

    Стайна температура, веднъж отворена, неизползваната ямка трябва да се запечата с пластмасов парафинов филм и да се съхранява десикант на стайна температура

    200μL ленти от 8 епруветки, ленти от

    8 капачки, плоча за събиране на 96 ямки, тава за отпадъци

    Стайна температура, 96 колекция от ямки

    плочата се запечатва и съхранява десиканта при стайна температура

     

    Бележки

    За вашата безопасност и здраве, моля, носете лабораторна престилка и ръкавици.

    Използвайте чисти съвети всеки път

    Моля, следвайте ръководството за съхранение и използване на реагентите

     

    Напишете вашето съобщение тук и ни го изпратете