проу
Продукти
Реагент за ин витро транскрипция T7 с висок добив (Термостабилен) HCP0036A Представено изображение
  • Реагент за ин витро транскрипция T7 с висок добив (термостабилен) HCP0036A

Реагент за ин витро транскрипция T7 с висок добив (термостабилен)


Каталожен номер:HCP0036A

Опаковка:50т

Комплект реагент за ин витро транскрипция T7 с висок добив (термостабилен) е способен на ин витро транскрипция при по-високи температури до 50°C.

Описание на продукта

Данни за продукта

Комплект реагент за ин витро транскрипция T7 с висок добив (термостабилен) е способен на ин витро транскрипция при по-високи температури до 50°C.Комплектът е в състояние да синтезира РНК транскрипти с висок добив, използвайки линейна двойноверижна ДНК, съдържаща Т7 промотор като шаблон и NTPs като субстрат.Комплектът е подходящ за включване на модифицирани нуклеотиди за получаване на белязана с биотин, белязана с багрило и радиомаркирана РНК.Комплектът също може да бъде приложен в синтеза на ко-транскрипционно покриващи иРНК с кап аналози.Комплектът съдържа модифицирани нуклеотиди N1-Me-pUTP като алтернатива.

Всяка стандартна реакция дава до 150-200 μg РНК от 1 μg ДНК шаблон.Размерът на реакцията може да бъде увеличен, за да се получи РНК на ниво милиграм, ако е необходимо.

РНК, синтезирана от комплекта, е подходяща за много приложения, включително изследвания на структурата и функцията на РНК, биохимия на рибозима, анализи за защита на РНКаза и базирани на хибридизация петна, анти-сенс РНК и RNAi експеримент.РНК, синтезирана от комплекта, също е подходяща за производство на ензимно производство на затворена РНК от vaccinia capping ензим и 2'-O-метилтрансфераза и се допълва с поли(А) полимераза за подобряване на стабилността и транслационната компетентност на РНК, използвана за in vitro транслация , трансфекция и микроинжекция.


  • Предишен:
  • Следващия:

  • Компоненти

    Компонент

    Концентрация

    Сила на звука

    АТФ

    100 тМ

    100 μL

    CTP

    100 тМ

    100 μL

    GTP

    100 тМ

    100 μL

    UTP

    100 тМ

    100 μL

    N1-Me-pUTP

    100 тМ

    100 μL

    10 × High-Yield IVT буфер A

    /

    100 μL

    Ензимна смес (термостабилна)

    /

    100 μL

     

    Условия за съхранение

    Транспортиране под 0°C и съхранение при -25~- 15°C.

     

    Протоколен

    •Подготовка на ДНК матрица

    Линеаризирана плазмидна ДНК, PCR продукти или синтетични ДНК олигонуклеотиди могат да се използват като шаблони за in vitro транскрипция с комплекта. ДНК шаблонът може да се разтвори в TE буфер или ddH2O без РНКаза.

    Плазмид шаблони: Линеаризираният плазмид трябва да съдържа Т7 промоторна област като ДНК шаблон.Качеството на линеаризирания плазмид влияе върху добива и целостта на РНК.Напълно линеаризиран плазмиден шаблон с най-висока чистота е от решаващо значение за успешното използване на комплекта, тъй като кръговият плазмид не е ефективно прекратен.Най-високият добив на транскрипция се постига с шаблон с най-висока чистота.За да се произведе РНК транскрипт с определена дължина, плазмидната ДНК трябва да бъде напълно линеаризирана с рестрикционен ензим, който генерира тъпи краища или 5'-надвеси.Линеаризираният плазмид, пречистен чрез лабораторни методи, може да бъде свободен от замърсяваща РНКаза, протеин, РНК и соли.

     PCR шаблони: PCR продукти, съдържащи Т7 РНК полимеразен промотор в правилната ориентация, могат да бъдат транскрибирани.По-добри добиви ще бъдат получени с пречистени PCR продукти, въпреки че PCR смесите могат да се използват директно.

    •Синтетичен ДНК олигонуклеотиди:Синтетични ДНК олигонуклеотиди, които са или изцяло двуверижни, или предимно едноверижни с двойноверижна Т7 промоторна последователност, могат да бъдат транскрибирани

    Протоколи за синтез на РНК

    Силно се препоръчва носенето на ръкавици и използването на епруветки и реагенти без нуклеаза, за да се избегне замърсяване с РНКаза.Реакциите с малък обем трябва да се събират в епруветки за микроцентрофуга без нуклеаза или епруветки с PCR ленти.

    Конвенционален синтез на РНК

    1. Размразете необходимите компоненти на комплекта, разбъркайте и пулсирайте в микроцентрофуга, за да съберете разтворите на дъното на епруветките.Дръжте върху лед.

    2.Ако планирате да проведете много реакции, удобно е да подготвите основна смес чрез комбиниране на равни обеми от 10 × Hi-Yield IVT буфер и четири рибонуклеотидни (NTP) разтвора.Използвайте 10 µl основна смес за реакция.

    3. Сглобете реакцията при стайна температура в следния ред:

    реагент

    Количество

    Вода без нуклеази

    X μL

    10 × High-Yield IVT буфер A

    2 μL

    ATP/CTP/GTP/UTP *(100 mM всеки)

    2 μL всеки (10 mM всеки край)

    Шаблонна ДНК

    Y μL (1 μg)

    Ензимна смес (термостабилна)

    2 μL

    Общ реакционен обем

    20 μL

    * За да се намали имуногенността на продукта, UTP може да бъде заменен с N1-Me-pUTP при същата крайна концентрация.

    4. Разбъркайте старателно, пулсово въртене в микроцентрофуга.Инкубирайте при 37°C за 2 часа или 50°C за 1 час, ако се изисква реакция при висока температура.

    5. Смилане на ДНК: За да премахнете шаблонна ДНК, добавете 10U DNase I към всеки 20 μL реакция, разбъркайте добре и инкубирайте при 37 ℃ за 30 минути.

     

    Затворен синтез на РНК

    Подобен протокол на конвенционалния синтез на РНК, с изключение на етапа на сглобяване на реакцията.Съберете реакцията на блокиран синтез на РНК при стайна температура в следния ред:

    реагент

    Количество

    Вода без нуклеази

    X μL

    10 × High-Yield IVT буфер A

    2 μL

    ATP/CTP/GTP/UTP *(100 mM всеки)

    2 μL всеки (10 mM всеки край)

    Капак аналог (100 mM)

    1,6 μL

    Шаблонна ДНК

    Y μL (1 μg)

    Ензимна смес (термостабилна)

    2 μL

    Общ реакционен обем

    20 μL

    *** Ако е необходимо, Cap1(3'OH AG) и cap1(3'OMe AG) могат да се използват като аналози на scap.Препоръчваме нашия ко-транскрипционен реагент Co-capping T7 инвитро транскрипционен реагент (pUTP, CAP GAG (3'OMe) , pUTP, CAP GAG, N1-Me- pUTP, CAP GAG (3'OMe) и N1-Me-pUTP, CAP GAG.

     

    пречистване на иРНК

    • Фенол: Хлороформ Екстрадействие и етанол Валежи

    За отстраняване на протеини и повечето от свободните нуклеотиди, екстракцията с фенол: хлороформ и утаяването с етанол на РНК транскрипти е предпочитаният метод.

    1. Коригирайте реакционния обем до 180 μL чрез добавяне на 160 μL вода без нуклеаза.Добавете 20 μL 3M натриев ацетат, pH5,2, разбъркайте добре.

    2. Екстрахирайте с равен обем от 1:1 смес фенол/хлороформ, центрофугирайте при 10000 rpm за 5 минути.Съберете водната фаза и прехвърлете в нова епруветка.

    3. Последвано от две екстракции с равен обем хлороформ.Съберете водната фаза и прехвърлете в нова епруветка.

    4. РНК се утаява с 2 обема етанол.Инкубирайте при -20 ℃ за поне 30 минути и съберете палетата чрез центрофугиране за 15 минути.Внимателно отстранете супернатантата.

    5. Изплакнете палетата със 150 μL~200 μL студен 70% етанол.

    6. Изсушете палетата на въздух за 2 минути и ресуспендирайте в 100 μL~200 μL вода без РНКаза или други буфери.

     

    • LiCl утаяване

    Утаяването на РНК с LiCl е ефективно за отстраняване на повечето невключени NTPs и ензими.

    1. Добавете равен обем разтвор на LiCl (5M), разбъркайте добре.

    2. Инкубирайте при -20 ℃ за поне 30 минути.Центрофугирайте при 4 ℃ при 12000 rpm за 15 минути, за да палетирате РНК.Внимателно отстранете супернатантата.

    3. Смолете палетата чрез добавяне на 200 μL предварително охладен 70% етанол.Внимателно отстранете етанола.Повторете стъпките 2~3 пъти.

    4. Изсушете палетата на въздух за 5~10 минути и ресуспендирайте в 100 μL~200 μL вода без РНКаза или други буфери.

    • Завъртане колонно пречистване

    Спин колоните ще премахнат невключените NTP, протеини и соли.

    • Магнитно мънисто пурификция

    Пречистването с магнитни перли може да премахне невключени нуклеотиди, протеини и соли.

     

    Количествено определяне на реакционните продукти

    • Количествено определяне от UV абсорбция на светлина: Реакционните продукти се нуждаят от пречистване, тъй като всякакви невключени нуклеотиди и матрична ДНК в реакционните смеси ще повлияят на отчитането.Измерването на UV спектрофотометрията при 260 nm може лесно да получи концентрация на РНК.За едноверижна РНК, 1 A260 съответства на концентрация на РНК от 40 μg/mL.

     Количествено определяне by багрило: Количественото определяне на реакционните продукти може да се използва с багрилото Ribogreen без пречистване, тъй като невключените нуклеотиди няма да повлияят на оценката на РНК продуктите.

      

    Бележки

    • Реакцията на транскрипция трябва да се извърши в среда без РНКаза.Препоръчително е да носите ръкавици.Накрайниците, епруветките и водата трябва да са без нуклеаза.

    • Цялата оптимална крайна концентрация на NTPs е 10 mM и можете да промените крайната концентрация на NTPs според действителното състояние.

    • Реакционната смес за синтез на РНК трябва да се приготви при стайна температура, тъй като ДНК може да се утаи в присъствието на спермидин при 4°C.

    • Добивът на транскрипти с подходяща дължина намалява, ако шаблонната ДНК е непълно линеаризирана.

    • Реакционната смес може да бъде увеличена или намалена.

    • Разбъркайте буфера, докато неразтворимите вещества се разтворят напълно преди употреба, ако се установи, че буферът има неразтворими вещества след повторното стопяване.

    • За реакции с транскрипти, по-къси от 300 bp, 4-8 часа инкубация при 37 ℃ трябва да ви даде по-висок добив.

    • ДНК матрицата, използвана за стандартни РНК синтезни транскрипти, трябва да съдържа Т7 промоторна последователност, последвана от GGG инициираща последователност, тъй като Т7 РНК полимеразата има по-висок афинитет към GTP.

    • ДНК матрицата, използвана за синтеза на иРНК със система за ко-транскрипция, трябва да съдържа Т7 промоторна последователност, последвана от AGG инициираща последователност.

    Отстраняване на неизправности

    а) Нисък добив на цяла лещаgth РНК:

    Ако реакцията на транскрипция генерира РНК с пълна дължина, но добивът е значително по-нисък от очаквания, възможно е замърсителите в ДНК матрицата да инхибират РНК полимеразата или концентрацията на ДНК да е твърде ниска или неправилна.

    Внушение: Препоръчва се допълнително пречистване на ДНК шаблона.

     

    b) РНК препис намазване на денатуринг Гел:

    Ако РНК изглежда разградена при денатуриране на агарозен или полиакриламиден гел, ДНК шаблонът или експерименталният процес са замърсени с РНКаза.

    Внушение: Ако плазмидната ДНК матрица е замърсена с РНКаза, извършете екстракция с фенол/хлороформ и преципитат с етанол.Уверете се, че накрайниците и епруветките, използвани по време на експеримента, не съдържат РНКаза.Моля, носете лабораторна престилка, маска и ръкавици за еднократна употреба.

     

    в) РНК препис на по-голям размер от очакваното:

    Ако РНК транскриптът изглежда по-голям от очакваното върху денатуриращ гел, матричната плазмидна ДНК може да не е усвоена напълно.Наличието на силни вторични структури може да доведе до това, че РНК транскриптът не е напълно денатуриран.

    Предложение: Проверете шаблона за пълно смилане, ако се потвърди несмлен плазмид, повторете смилането с рестрикционен ензим.Намалете вторичните структури на ДНК шаблона на етапа на проектиране на последователността.

     

    d) РНК препис на по-малък размер отколкото очакван:

    Ако анализът на денатуриращия гел покаже наличието на по-малки ивици от очаквания размер, това най-вероятно се дължи на преждевременно прекъсване от полимеразата.Някои последователности, които приличат на сигнали за терминиране на РНК полимераза на Т7, ще причинят преждевременно прекъсване.

    Предложение: Инкубирането на реакцията на транскрипция при по-ниски температури, например при 30°C, може да увеличи дела на транскрипта с пълна дължина, но добивът ще бъде намален.За GC богати шаблони или шаблони с вторични структури инкубацията при 42°C може да подобри добива на транскрипт с пълна дължина.

    Напишете вашето съобщение тук и ни го изпратете