Ензим за затваряне на вируса ваксиния

Капиращият ензим на вируса ваксиния се извлича от рекомбинантен щам на Е. coli, носещ гените за капиращия ензим ваксиния.Този единичен ензим е съставен от две субединици (D1 и D12) и има три ензимни активности (РНК трифосфатаза и гуанилилтрансфераза от D1 субединицата и гуанин метилтрансфераза от D12 субединицата).Капиращият ензим на вируса ваксиния е ефективен за катализиране на образуването на капачка, която може специфично да прикрепи 7-метилгуанилатната капачка (m7Gppp, Cap 0) към 5'-края на РНК.Cap структурата (Cap 0) играе важна роля в стабилизирането, транспорта и транслацията на иРНК в еукариотите.Затварянето на РНК чрез ензимна реакция е ефективен и прост метод, който може значително да подобри стабилността и транслацията на РНК за in vitro транскрипция, трансфекция и микроинжекция.

Компоненти

Ензим за затваряне на вируса ваксиния (10 U/μL)

10 × Буфер за затваряне

Условия за съхранение

-25～- 15℃ за съхранение （Избягвайте повтарящи се цикли на замразяване-размразяване）

Буфер за съхранение

20 mM Tris-HCl (рН 8,0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 50% глицерол.

Определение на единица

Една единица ензим за затваряне на вируса ваксиния се дефинира като количеството ензим, необходимо за включване на 10 pmol GTP в 80nt транскрипт за 1 час при 37°C.

Контрол на качеството

Екзонуклеаза:10U ензим за затваряне на вируса ваксиния с 1 μg λ-Hind III разградена ДНК при 37 ℃ за 16 часа не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.

Ендонуклеаза:10U ензим за затваряне на вируса ваксиния с 1 μg λDNA при 37 ℃ за 16 часа не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.

Никейз:10U ензим за затваряне на вируса ваксиния с 1 μg pBR322 при 37 ℃ за 16 часа не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.

РНКаза:10U ензим за затваряне на вируса ваксиния с 1,6 μg MS2 РНК за 4 часа при 37 ℃ не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.

1.coli ДНК:10U ензим за затваряне на вируса на ваксиния се изследва за наличие на геномна ДНК на E. coli с помощта на TaqMan qPCR с праймери, специфични за локуса на 16S rRNA на E. coli.Замърсяването на геномната ДНК на E. coli е ≤1 геном на E. coli.

2.бактериални Ендотоксин: LAL-тест, съгласно изданието на Китайската фармакопея IV 2020 г., метод за тестване на границата на гела, общо правило (1143).Съдържанието на бактериален ендотоксин трябва да бъде ≤10 EU/mg.

Реакционна система и условия

1. Протокол за затваряне (реакционен обем: 20 μL)

Тази процедура е приложима за реакция на затваряне на 10 μg РНК (≥100 nt) и може да бъде увеличена в съответствие с експерименталните изисквания.

I) Комбинирайте 10 μg РНК и H2O без нуклеаза в 1,5 ml епруветка за микроцентрофуга до краен обем от 15,0 µL.*10×затварящ буфер: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Загрейте при 65 ℃ за 5 минути, последвано от ледена баня за 5 минути.

3) Добавете следните компоненти в посочения ред

*10×затварящ буфер: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Инкубирайте при 37°C за 30 минути, РНК вече е затворена и готова за приложения надолу по веригата.

2. 5′ терминал реакция на етикетиране (реакционен обем: 20 μL)

Този протокол е предназначен за маркиране на РНК, съдържаща 5´ трифосфат, и може да бъде увеличен в съответствие с изискванията.Ефективността на включването на етикета ще бъде повлияна от моларното съотношение на РНК: GTP, както и от съдържанието на GTP в РНК проби.

1) Комбинирайте подходящо количество РНК и H2O без нуклеаза в 1,5 ml епруветка за микроцентрофуга до краен обем от 14,0 µL.

2) Загрейте при 65 ℃ за 5 минути, последвано от ледена баня за 5 минути.

3) Добавете следните компоненти в посочения ред.

** GTP MIX се отнася за GTP и малък брой маркери.За концентрацията на GTP вижтекъм бележка 3.

4) Инкубирайте при 37°C за 30 минути, РНК 5' краят вече е маркиран и готов за надолу по веригата

Приложения

1. Капиране на иРНК преди транслационни анализи/ин витро транслация

2. Маркиране на 5' края на иРНК

Бележки за употреба

1.Загряването на разтвора на РНК преди инкубиране с ензима за затваряне на ваксиниа премахва вторичната структура на 5'-края на транскрипта.Удължете времето до 60 минути за преписи с известни силно структурирани 5´краища.

2. РНК, използвана за затварящи реакции, трябва да бъде пречистена преди употреба и суспендирана във вода без нуклеаза.EDTA не трябва да присъства и разтворът не трябва да съдържа соли.

3. За маркиране на 5' края, общата концентрация на GTP трябва да бъде около 1-3 пъти моларната концентрация на иРНК в реакцията.

4. Обемът на реакционната система може да се увеличи или намали според действителното.