Двойноверижна РНК (dsRNA) ELISA КОМПЛЕКТ

Този комплект е ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA), свързан със система биотин-стрептавидин, за количествено измерване на dsRNA с дължина над 60 базови двойки (bp), независимо от последователността.Плаката е предварително покрита с анти-dsRNA антитяло.dsRNA, присъстваща в пробата, се добавя и се свързва с антитела, покрити върху ямките.След това се добавя биотинилирано анти-dsRNA антитяло и се свързва с dsRNA в пробата.След промиване се добавя HRP-стрептавидин, който се свързва с биотинилираното анти-dsRNA антитяло.След инкубиране несвързаният HRP-стрептавидин се отмива.След това се добавя субстратен разтвор на TMB и се катализира от HRP, за да се получи продукт със син цвят, който се променя в жълт след добавяне на киселинен стоп разтвор.Плътността на жълтото е пропорционална на целевото количество dsRNA, уловено в плаката.Абсорбцията се измерва при 450 nm.

Приложение

Този комплект е за количествено измерване на остатъчната dsRNA.

Компоненти на комплекта

Съхранение и стабилност

1. За неизползван комплект: Целият комплект може да се съхранява при 2~8 ℃ в срок на годност.Силната светлина трябва да се избягва за стабилност при съхранение.

2. За използван комплект: След като микроплаката бъде отворена, моля, покрийте неизползваните ямки с уплътнител за плаки и се върнете във фолиевата торбичка, съдържаща пакета със сушител, запечатайте фолиевата торбичка с цип и върнете до 2~8 ℃ възможно най-скоро след употреба.Други реагенти трябва да се върнат до 2~8 ℃ възможно най-скоро след употреба.

Необходими, но не са доставени материали

1. Четец на микроплаки с 450±10nm филтър (по-добре, ако може да открива при 450 и 650 nm дължина на вълната).

2. Шейкър за микроплаки.

3. Накрайници и центрофужни епруветки без РНКаза.

Диаграма на операциите

Преди да започнеш

1. Доведете всички компоненти на комплекта и проби до стайна температура (18-25 ℃) преди употреба.Ако комплектът няма да се използва наведнъж, моля, извадете само ленти и реактиви за настоящия експеримент и оставете останалите ленти и реактиви в необходимото състояние.

2. Промивен буфер: разредете 40 ml от 20 × концентриран промивен буфер със 760 ml дейонизирана или дестилирана вода, за да приготвите 800 ml от 1 × промивен буфер.

3. Стандартно: завъртете за кратко или центрофугирайте основния разтвор преди употреба.Концентрацията на четири предоставени стандарта е 5 ng/μL.За UTP и pUTP dsRNA стандарти, моля, разредете основния разтвор до 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL със STE буфер, за да начертаете стандартната крива.За стандарти N1-Me-pUTP dsRNA, моля, разредете основния разтвор до 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL със STE буфер, за да начертаете стандартната крива.За стандарт 5-OMe-UTP dsRNA, моля, разредете основния разтвор до 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL със STE буфер, за да начертаете стандартната крива.Препоръчваме стандартите да бъдат разредени като следните диаграми:

4. Биотинилирано антитяло за откриване и работен разтвор на HRP-стрептавидин: завъртете за кратко или центрофугирайте основния разтвор преди употреба.Разредете ги до работната концентрация с буфер за разреждане.

5. TMB подсъстояние: аспирирайте необходимата доза от разтвора със стерилизирани накрайници и не изсипвайте остатъчния разтвор отново във флакона.TMB субстратът е чувствителен към светлина, не излагайте TMB субстрата на светлина за дълго време.

Използване на протокол

1. Определете броя на лентите, необходими за анализа.Поставете лентите в рамките за употреба.Останалите ленти за плака, които не са използвани в този анализ, трябва да се опаковат отново в торбата със сушител.Затворете плътно опаковката за съхранение в хладилник.

2. Добавете 100 μL всяко от разрежданията на стандарта, празната проба и пробите в съответните ямки.Покрийте с уплътнителя за плочи.Инкубирайте за 1 час при стайна температура с разклащане при 500 rpm.Пробите трябва да се разредят със STE буфер до подходяща концентрация за точен анализ.

3. Стъпка на промиване: Аспирирайте разтвора и измийте с 250 μL промивен буфер за всяка ямка и го оставете да престои 30 секунди.Изхвърлете напълно промивния буфер, като щракнете плаката върху абсорбираща хартия.Измийте напълно 4 пъти.

4. Добавете 100 μL работен разтвор на биотинилирано антитяло за откриване във всяка ямка.Покрийте с уплътнителя за плочи.Инкубирайте за 1 час при стайна температура с разклащане при 500 rpm.

5. Повторете стъпката на пране.

6. Добавете 100 μL работен разтвор на HRP-стрептавидин във всяка ямка.Покрийте с уплътнителя за плочи.Инкубирайте за 30 минути при стайна температура с разклащане при 500 rpm.

7. Повторете стъпката на пране отново.

8. Добавете 100 μL разтвор на TMB субстрат във всяка ямка.Покрийте с уплътнителя за плочи.Инкубирайте за 30 минути при стайна температура. Пазете от светлина.Течността ще стане синя при добавяне на субстратен разтвор.

9. Добавете 50 μL стоп разтвор във всяка ямка.Течността ще стане жълта при добавяне на стоп разтвор.След това пуснете четеца на микроплаки и незабавно направете измерване при 450 nm.

Изчисляване на резултатите

1. Осреднете дублираните показания за всеки стандарт, контрола и проби и извадете средната нулева стандартна оптична плътност.Постройте стандартна крива с абсорбция по вертикалната (Y) ос и концентрация на dsRNA по хоризонталната (X） ос).

2. Препоръчва се изчислението да се извърши с компютърно базиран софтуер за напасване на крива като curve expert 1.3 или ELISA Calc в 5 или 4 параметърен нелинеен модел на напасване.

производителност

1. Чувствителност:

долна граница на откриване: ≤ 0,001 pg/μL (за UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (за 5-OMe-UTP-dsRNA).

долна граница на количествено определяне: 0,0156 pg/μL (за UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (за N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (за 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Прецизност: CV на вътрешно изследване ≤10%, CV на вътрешно изследване ≤10%

3. Възстановяване: 80%~120%

4. Линейност: 0,0156-0,5 pg/μL (за UTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (за N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/μL (за 5-OMe-UTP-dsRNA).

Съображения

1. Реакционната температура и времето на TMB са критични, моля, контролирайте ги стриктно според инструкциите.

2. За да се постигне добра възпроизводимост и чувствителност на анализа, правилното измиване на плаките за отстраняване на излишните нереагирали реагенти е от съществено значение.

3. Всички реагенти трябва да се смесят старателно преди употреба и да се избягват неравности по време на добавяне на проба или реагенти.

4. Ако в концентрирания промивен буфер (20x) са се образували кристали, загрейте до 37 ℃ и разбъркайте внимателно, докато кристалите се разтворят напълно.

5. Избягвайте анализ на проби, съдържащи натриев азид (NaN3), тъй като той може да унищожи активността на HRP, което води до подценяване на количеството dsRNA.

6. Избягвайте замърсяване с РНКаза по време на анализа.

7. Стандартът/пробата, антитялото за откриване и SA-HRP също могат да бъдат проведени при RT без разклащане, но това може да доведе до еднократно намаляване на чувствителността на откриване.За този случай препоръчваме UTP и pUTP dsRNA стандартите да се разреждат от 2 pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA стандартите трябва да се разреждат от 4 pg/μL и 5-OMe-UTP dsRNA стандартът трябва да се разрежда от 8 pg/μL.В допълнение, инкубирайте работния разтвор на HRP-стрептавидин за 60 минути при стайна температура.Не използвайте шейкър за колби, тъй като шейкърът за колби може да доведе до неточен резултат.

Типичен резултат

1. Данни за стандартна крива

2. Изчисляване на стандартна крива

3. Диапазон на откриване на линия: 0,0312- 1pg/μL