EndoFree Plasmid Maxi Kit
Този комплект е подходящ за екстракция от 150 – 300 ml бактериален разтвор, култивиран за една нощ, като се използва подобрен SDS-алкален метод за лизис за лизиране на бактериите.Суровият екстракт се комбинира селективно с уникален Endotoxin Scavenger и се разделя чрез центрофугиране за отстраняване на ендотоксините.След това мембраната от силикагел се свързва селективно с плазмидната ДНК в разтвора при условия на високо съдържание на сол и ниско рН.Това е последвано от добавяне на промивен буфер за отстраняване на примеси и други бактериални компоненти.Накрая се използва елуиращ буфер с ниско съдържание на сол и високо рН за елуиране на чиста плазмидна ДНК от мембраната на силиконовата матрица.Мембраната от силикагел използва специална адсорбционна мембрана и разликата в количеството на адсорбция между колоната и колоната е много малка и повторяемостта е добра.Не са необходими фенол, хлороформ и други токсични реагенти, както и етапи на утаяване с етанол.Този комплект може да се използва за бързо извличане на 0,2 -1,5 mg чиста плазмидна ДНК с високо копие, със степен на екстракция от 80% -90%.Комплектът използва уникална формула на процеса, премахва ендотоксина, съдържанието на ендотоксин е изключително ниско и ефектът на клетъчна трансфекция е отличен.Екстрахираният плазмид може да се използва директно в ензимно смилане, PCR, in vitro транскрипция, трансформация, секвениране и други експерименти на молекулярната биология.
Условия за съхранение
RNaseA трябва да се съхранява при -30 ~ -15 ℃ и да се транспортира при ≤0 ℃.
Endotoxin Scavenger може да се съхранява при 2 ~ 8 ℃ за един месец, съхранява се при -30 ~ -15 ℃ за дългосрочно съхранениеи транспортирани при ≤0℃.
Другите компоненти трябва да се съхраняват при стайна температура (15 ~25 ℃) и да се транспортират при стайна температура.
Компоненти
| Компоненти | 10RXNS |
| РНКаза А | 750 μL |
| Буфер P1 | 75 мл |
| Буфер P2 | 75 мл |
| Буфер P4 | 75 мл |
| Почиствач на ендотоксини | 25 мл |
| Буфер PW | 2 × 22 мл |
| Буферна туберкулоза | 20 мл |
| Колони FastPure DNA Maxi (всяка в епруветка за събиране от 50 ml) | 10 |
| Епруветка за събиране без ендотоксини | 2 × 5 |
RNAseA:10 mg/ml, използвани за отстраняване на РНК.
Буфер P1:бактериален суспензионен буфер, добавете RNaseA към буфер P1 преди първа употреба.
Буфер P2:буфер за бактериален лизис (съдържащ SDS/NaOH).
Буфер P4:неутрализиращ буфер.
Почиствач на ендотоксини:ефективно отстранява ендотоксина от суровия плазмиден екстракт.
Буфер PW:промивен буфер, добавете определения обем етанол преди първа употреба.
Буферен TB:елуиращ буфер.
FastPure DNA Maxi колони:колони за адсорбция на плазмидна ДНК.
Епруветки за събиране 50 ml:тръби за събиране на филтрат.
Епруветка за събиране без ендотоксини:епруветки за събиране на плазмидна ДНК.
Подготвени материали
Абсолютен етанол, изопропанол, 50 ml центрофужни епруветки с обло дъно и 50 ml без ендотоксиницентрофужни епруветки.
Приложения
Този продукт е подходящ за широкомащабно извличане на плазмиди от 150 - 300 ml бактериален разтворкултивирани за една нощ.
Експериментален процес
1. Вземете 150 – 200 ml (не повече от 300 ml) бактериален разтвор, култивиран за една нощ и центрофугирайте приоколо 11 000 rpm (12 000 × g) за 1 – 2 минути.Изхвърлете супернатантата и съберете бактерии.
Δ При събиране на повече от 50 ml бактериален разтвор, бактериите могат да бъдат събрани чрез добавяне на бактериален разтвор, центрофугиране, изхвърляне на супернатантата и други стъпки в същата епруветка от 50 ml за
много пъти.
2. Добавете 7,5 ml буфер P1 (моля, проверете дали към буфер P1 е добавена RNaseA) към центрофугатаепруветка, съдържаща бактерии, и разбъркайте старателно чрез вортекс или пипетиране.
Δ Пълното ресуспендиране на бактерии в тази стъпка е от решаващо значение за добива и не трябва да има бактериални бучки след ресуспендиране.Ако има бактериални бучки, които не са напълно смесени, това ще повлияе на лизиса, което ще доведе до нисък добив и чистота.Ако OD600 на бактериален разтвор е 0,65, се препоръчва да се използват 7,5 ml буфер P1 при екстракция от 150 ml бактериален разтвор;когато OD600 е 0,75, трябва да се използват 8 ml буфер P1 и обемите на буферите P2 и P4 трябва да се променят съответно.Ако обемът на бактериалния разтвор се увеличи до 200 ml, се препоръчваобемът на буферите P1, P2 и P4 се увеличава пропорционално.
3. Добавете 7,5 ml буфер P2 към бактериалната суспензия от стъпка 2 и разбъркайте внимателно нагоре и надолу за 6 – 8пъти и инкубирайте при стайна температура за 4 – 5 минути.
Δ Обърнете внимателно, за да смесите напълно.Завихрянето ще причини фрагментация на геномна ДНК, което ще доведе до геномни ДНК фрагменти в извлечения плазмид.По това време разтворът става вискозен и полупрозрачен, което показва, че бактериите са напълно лизирани.Продължителността не трябва да надвишава 5 минути, за да се избегне разрушаването на плазмидите.Ако разтворът не е бистър, това може да доведе до твърде много бактериинепълен лизис, така че количеството на бактериите трябва да се намали по подходящ начин.
4. Добавете 7,5 ml буфер P4 към бактериалната суспензия от стъпка 3 и веднага обърнете внимателно 6 – 8 пъти, за да позволите на разтвора да неутрализира напълно буфер P2.По това време трябва да се появи бяла флокулентна утайка.Центрофугирайте при повече от около 11 000 rpm (12 000 × g) за 10 – 15 минути, внимателно пипетирайте супернатантата в нова центрофужна епруветка с кръгло дъно от 50 ml (самоподготвена) и избягвайтеаспирирайте плаващата бяла утайка.
Δ Добавете буфер P4 и незабавно обърнете, за да се смеси добре.Оставете епруветката да престои, докато бялата утайка се разпредели равномерно в разтвора, за да предотвратите образуването на локална утайка, която може да повлияе на неутрализацията.Ако няма равномерна бяла флокулентна утайка преди центрофугирането и супернатантата не е бистра след центрофугирането, епруветката може да бъдецентрофугира се още 5 минути.
5. Добавете 0,1 пъти обема (10% от обема на супернатанта, около 2,2 ml) от Endotoxin Scavenger към супернатанта от стъпка 4 и обърнете, за да се смеси.Поставете разтвора в ледена баня или го поставете в натрошен лед (или хладилник с фризер) за 5 минути, докато разтворът се промени от мътен на бистър и прозрачен (или все ощелеко мътна) и от време на време се разбърква няколко пъти.
Δ След добавяне на Endotoxin Scavenger към супернатантата, супернатантата ще стане мътна, носупернатантата трябва да стане бистра (или леко мътна) след охлаждане в ледената баня.
6. След като супернатантата се постави на стайна температура (>25℃) за 10 – 15 минути, тя ще стане мътна, тъй катотемпературата му се повишава до стайна.След това супернатантата трябва да се обърне, за да се смеси.
Δ Ако стайната температура е по-ниска или искате да намалите времето за екстракция, супернатантата може да се инкубира във водна баня с температура 37 ~ 42 ℃ за 5 – 10 минути и следващата стъпка може да се извърши след супернатантастава мътен.
7. Центрофугирайте супернатантата при около 11 000 rpm (12 000 × g) за 10 минути при стайна температура (температурата трябва да е >25 ℃), за да се отдели фазата.Горната водна фаза съдържа ДНК, докато долният син маслен слой съдържа ендотоксин и други примеси.Прехвърляне наДНК-съдържаща водна фаза в нова епруветка иизхвърлете мазния слой.
Δ Температурата по време на центрофугирането трябва да бъде над 25 ℃, тъй като ефективното разделяне на фазите не го правивъзниква, ако температурата е твърде ниска.
Δ Ако фазовото разделяне не е ефективно, температурата на центрофугиране може да се регулира на 30 ℃ ивремето за центрофугиране може да се увеличи до 15 минути.
Δ Не изсмуквайте синия мазен слой, тъй като съдържа ендотоксин и други примеси.
Механизъм
Ресуспензия Лизис Неутрализация
◇ Добавете 7,5 ml буфер P1
◇ Добавете 7,5 ml буфер P2
◇ Добавете 7,5 ml буфер P4
Отстраняване на ендотоксини
◇ Добавете 0,1 пъти обема на супернатанта от Endotoxin Scavenger
Подвързване и пране
◇ Добавете 0,5 пъти обема изопропанол
◇ Добавете 10 ml буфер PW
◇ Добавете 10 ml буфер PW
Елуиране
◇ Добавете 1 – 2 ml буфер TB или ddH2O без ендотоксин
