M-MLV обратна транскриптаза
RevScript Обратната транскриптаза се получава чрез технология на генното инженерство.Има по-висока способност за синтез на кДНК, термична стабилност и граница на температурата на реакцията (до 60°C).Синтезираният cDNA продукт е до 10 kb.Той повишава афинитета на шаблоните и е подходящ за обратна транскрипция на РНК шаблони със сложна вторична структура или гени с ниско копие.
Компоненти
| Компонент | HC2003B (10 000U) | HC2003B (5*10 000U) | HC2003B (200 000U) |
| RevScript обратна транскриптаза (200U/μL) | 50 μL | 5 × 50 μL | 1 мл |
| 5 × RevScript буфер | 250 μL | 1,25 мл | 5 мл |
Условия на съхранение
Този продукт трябва да се съхранява при -25°C~-15°C в продължение на 2 години.
Определение на единица
Една единица включва 1 nmol dTTP в неразтворим в киселина материал за 10 минути при 37°C, използвайки Oligo(dT) като праймери.
Настройка на реакцията
1.Денатуриране на РНК шаблон (Тази стъпка не е задължителна, денатурирането на РНК шаблон помага да се отворят вторичните структури, което ще подобри добива на първата верига сДНК.)
| Компоненти | Сила на звука (μL) |
| Без РНКаза ddH2O | до 13 |
| Олиго(dT)18 (50 μmol/L) или случаен праймер (50 μmol/L) Или генно специфични праймери (2 μmol/L) | 1 |
| или 1 | |
| или 1 | |
| РНК шаблон | X a |
Бележки:
1) a: Обща РНК: 1-5 ug или иРНК: 1-500 ng
2) Инкубиране при 65°C за 5 минути, след което незабавно прехвърляне върху лед за охлаждане за 2 минути.Кратко центрофугиране за събиране на реакционната течност, добавете реакционния разтвор за обратна транскрипция, както е показано в следващата таблица.Внимателно пипетирайте, за да смесите.
1.Приготвяне на реакционната смес (20 μL обем)
| Компоненти | Сила на звука (μL) |
| Смес от предишната стъпка | 13 |
| 5×Буфер | 4 |
| dNTP смес (10nmol/L) | 1 |
| Обратна транскриптаза (200 U/μL) | 1 |
| РНКазен инхибитор (40 U/μL) | 1 |
1.Извършете реакцията при следните условия:
| Температура (°C) | време |
| 25 °Ca | 5 минути |
| 42 °Cb | 15-30 минути |
| 85 °Cc | 5 минути |
Бележки:
1) а.Инкубиране при 25°C за 5 минути е необходимо само за използване на произволни хексамери.Моля, пропуснете тази стъпка, когато използвате Oligo (dT)18или Gene Specific Primer.
2) б.Препоръчителната температура на обратна транскрипция е 42°C. За шаблони със сложни вторични структури или високо съдържание на GC се препоръчва да се повиши реакционната температура до 50-55°C.
3) c.Нагряване при 85°C в продължение на 5 минути за инактивиране на обратната транскриптаза.
4) Продуктът може да се използва директно в PCR или qPCR реакции или да се съхранява при -20°C за краткосрочно съхранение.Препоръчително е продуктите да се алигутират и съхраняват при -80°C за дългосрочно съхранение.Избягвайте честото замразяване-размразяване.
5) Продуктът е подходящ за едноетапна RT-qPCR, препоръчва се добавяне на 10-20 U обратна транскриптаза за всеки 25 μL реакционна система или постепенно увеличаване на количеството обратна транскриптаза според действителната ситуация.
Бележки
1.Моля, поддържайте експерименталната зона чиста;По време на работа трябва да се носят чисти ръкавици и маски.Всички консумативи, използвани в експеримента, не трябва да съдържат РНКаза, за да се предотврати замърсяване с РНКаза.
2.Всички процедури трябва да се извършват върху лед, за да се предотврати разграждането на РНК.
3.Препоръчват се висококачествени РНК проби, за да се осигури висока ефективност на обратната транскрипция.
4.Този продукт е само за изследователска употреба.
5.Моля, работете с лабораторни престилки и ръкавици за еднократна употреба, за ваша безопасност.
