иРНК Cap2'-O-метилтрансфераза

mRNA Cap 2´-O-methyltransferase е получена от рекомбинантен щам на Е. coli, който носи гена за vaccinia mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase.Този ензим добавя метилова група в позиция 2´-O на първия нуклеотид, съседен на капачката на структурата в 5'-края на РНК. Ензимът използва S-аденозилметионин (SAM) като метилов донор за метилиране на капачката на РНК (кап. -0), което води до структура cap-1.

Структурата Cap1 може да повиши ефективността на транслацията, подобрявайки експресията на иРНК при трансфекция и експерименти с микроинжектиране. Този ензим изисква специално РНК с m7GpppN капачка като субстрат.Не може да използва РНК с pN, ppN, pppN или GpppN в 5' края.Затворената РНК може да бъде получена чрез in vitro транскрипция, като се използва кап аналог или чрез ензимно затваряне, като се използва ензимът за затваряне на ваксиниа.

Компоненти

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×Capping Reaction Buffer

Съхранение

-25 ～- 15 ℃ за съхранение （ Избягвайте повтарящи се цикли на замразяване-размразяване）

Буфер за съхранение

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100， 50% глицерол.

Дефиниция на единица

Една единица се дефинира като количеството ензим, необходимо за метилиране на 10 pmoles от 80 nt капиран РНК транскрипт за 1 час при 37°C.

Анализи за контрол на качеството

Екзонуклеаза:50U от mRNA Cap 2 ´ -O-метилтрансфераза с 1 μg λ-Hind III смляна ДНК при 37 ℃ за 16 часа не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.

Ендонуклеаза: 50 U от mRNA Cap 2´ -O-метилтрансфераза с 1 μg λDNA при 37 ℃ за 16 часа не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.

Nickase: 50U от mRNA Cap 2´ -O-метилтрансфераза с 1 μg pBR322 при 37 ℃ за 16 часа не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.

РНКаза: 50 U от mRNA Cap 2´ -O-метилтрансфераза с 1,6 μg MS2 RNA за 4 часа при 37 ℃ не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.

E. коли ДНК: 50U от иРНК Cap 2´ -O-метилтрансфераза се изследва за наличие наE. коли геномна ДНК с помощта на TaqMan qPCR с праймери, специфични заE. коли 16S рРНК локус.TheE. коли замърсяването на геномна ДНК е =1E. коли геном.

бактериални Ендотоксин: LAL-тест, съгласно изданието на Китайската фармакопея IV 2020 г., метод за тестване на границата на гела, общо правило (1143).Съдържанието на бактериален ендотоксин трябва да бъде =10 EU/mg.

Реакционна система и условия

1. Комбинирайте подходящо количество затворена РНК и свободна от РНКаза H2O в 1,5 mL микроцентрофужна епруветка до краен обем от 16,0 µL.

2. Загрейте при 65 ℃ за 5 минути, последвано от ледена баня за 5 минути.

3. Добавете следните компоненти в посочения ред (за метилиране на затворена РНК

по-малко от 10

*10 × затварящ реакционен буфер: 500 mM Tris-HCl (рН 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.

4. Инкубирайте при 37 ℃ за 1 час (2 часа инкубация се препоръчват за целевия фрагмент под 200 nt).

Приложения

За подобряване на експресията на иРНК по време на експерименти с микроинжектиране и трансфекция.

Бележки за употреба

1. Преди реакция РНК трябва да се пречисти и разтвори във вода без нуклеаза, всички разтвори не трябва да съдържат EDTA и йони.

2. Препоръчва се пробата РНК да се загрее при 65 ℃ за 5 минути преди реакцията, за да се отстрани вторичната структура в 5'-края на транскрипта.Може да се удължи до 10 минути за сложна 5 ´-терминална структура.