проу
Продукти
Комплект за анализ на Рназа (флуоресценция) HCP0035A Представено изображение
  • Комплект за анализ на Рназа (флуоресценция) HCP0035A

Комплект за анализ на Рназа (флуоресценция)


Каталожен номер:HCP0035A

Опаковка: 48T/96T

Комплектът за откриване на РНКаза се основава на РНК сонда, маркирана с флуорофор.

Описание на продукта

Данни за продукта

Комплектът за откриване на РНКаза се основава на РНК сонда, маркирана с флуорофор.Когато пробата не съдържа РНКазна активност, сондата е стабилна и не произвежда флуоресцентен сигнал;когато пробата съдържа РНКазна активност, сондата се разгражда, което води до постепенно усилен флуоресцентен сигнал;скоростта на нарастване на флуоресцентния сигнал е в положителна корелация с броя и активността на ензимите.Използвайте флуоресцентен четец на микроплаки за измерване при дължина на вълната ex/em=535/575n, за да определите дали пробата е замърсена с РНКаза.


  • Предишен:
  • Следващия:

  • Приложение

    Този комплект се използва за откриване на замърсяване с РНКаза в проби.

     

    Cкомпоненти

    Име

    HCP0035A-01

    (192T)

    HCP0035A-02

    (48T)

    10 × реакционен разтвор

    2,0 мл

    0,5 мл

    РНК сонда

    1 тръба

    1 тръба

    TE буфер

    2,0 мл

    0,5 мл

    РНКаза A стандарт (10 mg/mL)

    20μL

    10μL

    Стандартен буфер за разреждане

    12 мл

    6mL

    Вода без DNase&RNase

    25mL

    25mL

    ДНКаза РНКаза далеч

    50 мл

    50 мл

     

    Съхранение и стабилност

    1. Транспортиран при -25 ~ – 15 ℃;

    2.Различните компоненти на комплекта се съхраняват отделно според температурата:

    Име

    температура

    10 × реакционен разтвор

    -25 ~ – 15 ℃

    РНК сонда

    -25 ~ – 15 ℃

    TE буфер

    -25 ~ – 15 ℃

    РНКаза A стандарт (10 mg/mL)

    -25 ~ – 15 ℃

    Стандартен буфер за разреждане

    -25 ~ – 15 ℃

    Вода без DNase&RNase

    -25 ~ 30 ℃

    ДНКаза РНКаза далеч

    2 ~ 30 ℃

    3. Съхранявайте неотворения комплект 12 месеца.

    4.Съхранявайте комплекта 6 месеца след отваряне.Препоръчва се аликвотиране на разтвора на РНК сондата според количеството за еднократна употреба, за да се избегне светлина и многократно замразяване и размразяване.

     

    Необходима техника и консумативи

    1.Четец на флуоресцентни микроплаки (включително ex/em=535/575nm дължина на вълната)

    2. Пипети и накрайници без DNase&RNase

    3. EP тръба без DNase&RNase

    4. Без ДНКаза и РНКаза черна непрозрачна 96-ямкова плака

    Подготовка на реагента

    1.Извадете комплекта и го уравновесете до стайна температура (18~25 ℃), разклатете и смесете компонентите като 10× реакционен разтвор, TE буфер, RNase A стандарт (10 mg/mL), стандартен буфер за разреждане и след това незабавно центрофугирайте.(Центрифугирайте при 4000~7000rpm за 10 секунди).

     2. Центрофугирайте РНК сондата при 4000~7000 об./мин. за 60 секунди, за да я съберете на дъното на епруветката, внимателно отворете капачката на епруветката и добавете 40 μL TE буфер, за да се разтвори като разтвор за съхранение на РНК сондата, аликвотирайте разтвора за съхранение на РНК сондата според до количеството за еднократна употреба и ги съхранявайте при -25 ~ -15 °C, за да избегнете повторно замразяване и размразяване.Изваждайте разтвора за съхранение на сондата при всеки тест, разреждайте го 50 пъти с TE буфер (например добавете 490 μL TE буфер към 12 μL РНК сонда) като работен разтвор за РНК сонда.Съхранявайте остатъка от работния разтвор на РНК сондата при -25 ~ -15 °C, за да избегнете светлина и многократно замразяване и размразяване.

     

    Стъпки на откриване

    1. Стъпка, за да зададете подходящо усилване преди първия тест, за да избегнете риска от загуба на чувствителност или пренасищане на сигнала.

    1) параметри на инструмента:

    Разклащане на плочата 10 ~ 15 s преди откриване;

    Дължина на вълната на възбуждане λEx=535nm;

    Дължина на вълната на излъчване λEm=575nm;

    Използвайте функцията за автоматично усилване;

    Температура 37℃;

    Режим на крайна точка.

    Задайте усилването на автоматично мащабиране, ако е възможно, като алтернатива първоначално използвайте средна настройка на усилването.

    Забележка: методът на настройка на различните инструменти не е последователен, моля, консултирайте се с доставчика на инструмента за подробности.

    2) Изберете 2 ямки на 96-ямкова плака, добавете 10 μL работен разтвор на РНК сондата и 10 μL 10 × реакционен разтвор към всяка ямка;

    3) Добавете 80 μL вода без ДНКаза и РНКаза към едната ямка и добавете 79 μL вода без ДНКаза и РНКаза и 1 μL стандарт на РНКаза А (100 mg/mL) към другата ямка.

    4) Поставете плаката на тъмно място при 37°C и го тествайте след 30 минути.

    5) Ако зададете усилването на автоматично мащабиране, стойността на усилването ще се покаже в лентата с параметри на инструмента на файла с данни, означена като G1.

    6) Когато първоначално използвате настройка за средно усилване, трябва да се отбележи, че: ако високата стойност на флуоресценция надвишава горната граница на инструмента, стойността на усилването трябва да бъде намалена по подходящ начин;ако високата стойност на флуоресценция е далеч под горната граница на инструмента, стойността на усилването трябва да се увеличи по подходящ начин;Накрая се получава подходящата стойност на усилване, означена като G2.

    2. Сet параметрите на инструмента:

    Разклащане на плочата 10 ~ 15 s преди откриване;

    Дължина на вълната на възбуждане λEx=485nm;

    Дължина на вълната на излъчване λEm=525nm;

    Задайте стойността на усилване на G1 или G2, получена в стъпка 1;

    Температура 37℃;

    Ако четецът на микроплаки поддържа кинетичен режим, препоръчително е да използвате режима на кинетично откриване, с интервал от 1 до 1,5 минути, като общото време е 30 минути.

    3.приготвяне на пробата

    Препоръчителният обем на пробата е 80 μL.Ако пробата за тестване е по-малка от 80 μL, разредете до 80 μL с вода без DNase&RNase.

    Когато пробата за тестване съдържа вещества, които влияят на луминесценцията на флуорофора (като тъмни разтвори, висококонцентрирани вискозни вещества или повърхностноактивни вещества), пробата трябва да се разреди с вода без ДНКаза и РНКаза, но имайте предвид, че операцията по разреждане ще повлияе чувствителността.За пробата за тестване, която съдържа инхибитори на РНКазната активност (като разтвори с висока йонна сила, pH<4 или pH>9 буфери, протеинови денатуранти и др.), резултатът от измерването е общата ензимна активност на разтвора на пробата, а не индивидуална активност на ензима.

     

    Разредете стандарта DNase I (10 mg/mL) със стандартен буфер за разреждане, както следва: 

    Не.

    подготвителен процес

    Концентрация

    1

    2 μL RNase A стандарт + 198 μL стандартен буфер за разреждане

    0,1 мг/мл

    2

    2 μL проба № 1 + 198 μL стандартен буфер за разреждане

    1 × 10-3 mg/mL

    3

    2 μL проба № 2 + 198 μL стандартен буфер за разреждане

    1 × 10-5 mg/mL

    4

    2 μL проба № 3 + 198 μL стандартен буфер за разреждане

    1 × 10-7 mg/mL

    5

    100 μL проба № 4 + 100 μL стандартен буфер за разреждане

    5 × 10-8 mg/mL

     Разредете проба № 5 с вода без ДНКаза и РНКаза 10 пъти:

    6

    20 μL проба № 5 + 180 μL DNase и вода без RNase

    5 × 10-9 mg/mL,

    5 pg/mL

    Проба № 6 се използва като положителна контрола;Като отрицателна контрола се използва вода без DNase&RNase.

    4.Дозиране и тестване

    1) Добавете 10 μL работен разтвор на РНК сонда и 10 μL 10 × реакционен разтвор към 96-ямкова плака.Изберете 4 ямки, за да добавите съответно отрицателната контрола и положителната контрола, и другите ямки, за да добавите пробите за тестване.Има 2 множество ямки за всяка проба, 80 μL за всяка ямка;

    2) Незабавно тествайте и прочетете стойността на флуоресцентния сигнал RFU0 за 0 минути.След като бъде поставен на тъмно при 37 ℃ за 30 минути, тествайте и прочетете отново стойността на флуоресцентния сигнал RFU30 за 30 минути.Ако се приеме динамичен режим, всички флуоресцентни сигнали за 0~30 минути могат да бъдат прочетени.

     

    Тълкуване на резултатите от теста

    Ако RFU30≥2×RFU0, се счита, че пробата за тестване е замърсена с РНКаза.

    Забележка: ако пробата за тестване е сериозно замърсена или съдържа смущаващи вещества, може да се случи RFU0 (проба за тестване) > RFU0 (положителен качествен контрол) и RFU30 (проба за тестване) < 2 ×RFU0 (проба за тестване) тествани), което води до фалшива отрицателна преценка.По това време пробата, която ще се тества, се разрежда предварително с вода, свободна от ДНКаза и РНКаза, и след това се тества.

     

    Количествено откриване

    Когато пробата за тестване е замърсена и е необходимо да се прецени стойността на концентрацията на РНКаза в пробата, тя може да се определи чрез следните процедури:

     

    Разредете стандарта на РНКаза А (10 mg/mL) със стандартен буфер за разреждане, както следва:

    Не.

    Процес на подготовка

    концентрация

    1

    2μL РНКаза A стандарт +198μL стандартен буфер за разреждане

    0,1 мг/мл

    2

    2 μL проба № 1 + 198 μL стандартен буфер за разреждане

    1×10-3mg/mL

    3

    2 μL проба № 2 + 198 μL стандартен буфер за разреждане

    1×10-5mg/mL

    4

    2 μL проба № 3 + 198 μL стандартен буфер за разреждане

    1×10-7mg/mL

    5

    100 μL проба No.4 + 100 μL стандартен буфер за разреждане

    5×10-8 mg/mL

    6

    100 μL проба No.5 + 100 μL стандартен буфер за разреждане

    2,5 × 10-8 mg/mL

    7

    100 μL проба № 6 + 100 μL стандартен буфер за разреждане

    1,25 × 10-8 mg/mL

    8

    100 μL проба № 7 + 100 μL стандартен буфер за разреждане

    6,25 × 10-9 mg/mL

    9

    100 μL проба № 8 + 100 μL стандартен буфер за разреждане

    3. 125 × 10-9 mg/mL

    След това разредете проби № 6 ~ № 9 с вода без ДНКаза и РНКаза 10 пъти:

    10

    20μLNo.6 проба+180 μL DNase&вода, свободна от RNase

    2,5 × 10-9 mg/mL

    11

    20 μL проба № 7 + 180 μL DNase& вода, свободна от RNase

    1,25 × 10-9 mg/mL

    12

    20 μL проба № 8 + 180 μL DNase& вода, свободна от RNase

    6,25 × 10-10 mg/mL

    13

    20 μL проба № 9 + 180 μL DNase& вода, свободна от RNase

    3. 13×10-10 mg/mL

     

    Проби № 10 ~ № 13 се използват като стандарти;Вода без ДНКаза и РНКаза като проба с 0 концентрация.

    Тествайте проба с нулева концентрация, стандарти и замърсена проба заедно в съответствие със стъпките за откриване, за да получите RFU0 и RFU30.

     

    Изчислете ∆RFU = RFU30-RFU0, вземете ∆RFU (0 концентрация) и ∆RFU (стандарт) като ордината и концентрацията на РНКаза на стандарта като абциса (0 концентрация е 0), извършете линейно напасване и изчислете напасващото уравнение y = ax + B, а коефициентът на корелация r трябва да бъде ≥ 0,99.Поставете ∆RFU (замърсена проба) в уравнението като y, изчислете x и го умножете по кратното предварително разреждане на пробата, за да получите приблизителната стойност на концентрацията на замърсената проба.

    Забележка: Поради флуктуация на сигнала на инструмента може да се случи ∆RFU<0, в този момент се изчислява като ∆RFU=0.

     

    Ефективност на откриване

    1. Граница на откриване: РНКаза A: 0,313 pg/mL,~ 1,56 × 10-9U/μL

    2.Прецизност: вътрешнопартиден коефициент на вариация ≤ 10%, междупартиден коефициент на вариация ≤ 15%

     

    внимание

    1. Операцията по добавяне на проба трябва да бъде възможно най-бърза.Твърде дълго време ще повлияе на точността на експеримента.

    2. Параметрите на различните инструменти за маркиране на флуоресцентни ензими са различни.Задайте подходящо усилване преди първия тест.

    3. Всички реагенти трябва да се разклатят напълно преди употреба.При добавяне на проби, добавените проби трябва да се добавят на дъното на кладенчето на плочата с ензимен етикет, за да се избегне добавянето им към горната част на стената на гнездото.Когато добавяте проби, внимавайте да не пръскате или генерирате мехурчета.

    4. Стандартът в комплекта е РНКаза А и нейната активна единица се определя като една единица от ензима причинява увеличение на абсорбцията от 1,0 при 260 nm, когато РНК на дрожди се хидролизира при 37 °C и pH 5,0[1].Петдесет единици са приблизително еквивалентни на 1 Kunitz единица[2].

    5.За да се избегне екзогенно замърсяване с RNase, DNase RNase away може да се напръска върху повърхността на експерименталната маса, ръкавиците и други повърхности.След 5 минути ги почистете с чисти хартиени кърпи и след това извършете следващите експериментални операции.

     

     

     

    Напишете вашето съобщение тук и ни го изпратете