PNGase F
Пептид-N-гликозидаза F (PNGase F) е най-ефективният ензимен метод за отстраняване на почти всички N-свързани олигозахариди от гликопротеини.PNGase F е амидаза, която разцепва най-вътрешните GlcNAc и аспарагиновите остатъци на високоманозни, хибридни и сложни олигозахариди от N-свързани гликопротеини.
Приложение
Този ензим е полезен за отстраняване на въглехидратните остатъци от протеините.
Подготовка и спецификация
| Външен вид | Безцветна течност |
| Чистота на протеина | ≥95% (от SDS-PAGE) |
| Дейност | ≥500 000 U/mL |
| Екзогликозидаза | Не може да бъде открита никаква дейност (ND) |
| Ендогликозидаза F1 | ND |
| Ендогликозидаза F2 | ND |
| Ендогликозидаза F3 | ND |
| Ендогликозидаза Н | ND |
| Протеаза | ND |
Имоти
| EC номер | 3.5.1.52(Рекомбинант от микроорганизъм) |
| Молекулно тегло | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Изоелектрична точка | 8. 14 |
| Оптимално pH | 7,0-8,0 |
| Оптимална температура | 65 °C |
| Специфика на субстрата | Разцепване на гликозидни връзки между GlcNAc и аспарагинови остатъци Фиг.1 |
| Сайтове за разпознаване | N-свързани гликани, освен ако не съдържат α1-3 фукоза Фиг. 2 |
| Активатори | DTT |
| инхибитор | SDS |
| Температура на съхранение | -25 ~ -15 ℃ |
| Топлинно инактивиране | 20 µL реакционна смес, съдържаща 1 µL PNGase F, се инактивира чрез инкубиране при 75 °C за 10 минути. |
Фиг. 1 Субстратна специфичност на PNGase F
Фиг. 2 Места за разпознаване на PNGase F.
Когато вътрешните GlcNAc остатъци са свързани с α1-3 фукоза, PNGase F не може да разцепи N-свързани олигозахариди от гликопротеини.Тази модификация е често срещана в растенията и някои гликопротеини на насекоми.
Cкомпоненти
|
| Компоненти | Концентрация |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10 × гликопротеинов денатуриращ буфер | 1000 µl |
| 3 | 10×Гликобуфер 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Дефиниция на единица
Една единица (U) се определя като количеството ензим, необходимо за отстраняване на >95% от въглехидратите от 10 µg денатурирана РНКаза В за 1 час при 37°C в общ реакционен обем от 10 µL.
Условия на реакцията
1. Разтворете 1-20 µg гликопротеин с дейонизирана вода, добавете 1 µl 10 × гликопротеинов денатуриращ буфер и H2O (ако е необходимо), за да получите 10 µl общ реакционен обем.
2.Инкубира се при 100°C за 10 минути, охлажда се върху лед.
3.Добавете 2 µl 10 × GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 и разбъркайте.
4.Добавете 1-2 µl PNGase F и H2O (ако е необходимо), за да получите 20 µl общ реакционен обем и разбъркайте.
5.Инкубирайте реакцията при 37°C за 60 минути.
6.За SDS-PAGE анализ или HPLC анализ.
