Урацил ДНК гликозилаза
Урацил-ДНК гликозилазата (UNG или UDG) е рекомбинантен клонинг на E.coli с молекулно тегло 25 kDa.Той катализира освобождаването на свободен урацил от урацил-съдържаща едноверижна и двойноверижна ДНК и е неактивен срещу РНК и може да се използва за предотвратяване на замърсяване на PCR продукти за амплификация.Принципът на действие се основава на факта, че ако dUTP се замести с dTTP в PCR реакцията и се образува продукт на PCR амплификация, съдържащ dU бази, ензимът може селективно да разруши гликозидната връзка на U бази в едноверижни и двойноверижни ДНК и разградете продукта на PCR амплификация.
Препоръчително приложение
Предотвратяване на замърсяване Усилване
Условия на съхранение
-20°C за дългосрочно съхранение, трябва да се смеси добре преди употреба, избягвайте често замразяване-размразяване.
Буфер за съхранение
20 mM Tris-HCl (рН 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, стабилизатор, 50% глицерол.
Определение на единица
Количеството ензим, необходимо за разграждане на 1 µg едноверижна ДНК, съдържаща dU бази, за 1 час при 37°C е 1 единица.
Контрол на качеството
1.SDS-PAGE електрофоретична чистота над 98%
2.Чувствителност на усилване, контрол от партида до партида, стабилност
3.След като 1U UNG се третира при 50 ℃ в продължение на 2 минути, шаблонът, съдържащ U под 103 копия, трябва да бъде напълно разграден и не може да се произведе продукт на амплификация
4.Няма екзогенна нуклеазна активност
Инструкции
| Компоненти | Обем (μL) | Крайна концентрация |
| 10 × PCR буфер (без dNTP, Mg²+Безплатно) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (заместете dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 тМ |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Грунд смеса | 2 | 1× |
| Шаблон | - | <1μg/реакция |
| ddH2O | До 50 | - |
Забележка: a: Ако се използва за qPCR/qRT-PCR, флуоресцентната сонда трябва да се добави към реакционната система.Обикновено крайна концентрация на праймер от 0,2 μM може да даде добри резултати;когато ефективността на реакцията е лоша, концентрацията на праймера може да се регулира в диапазона от 0,2-1 μM.Обикновено концентрацията на сондата се оптимизира в диапазона от 0,1-0,3 μM.Могат да се извършат експерименти с градиент на концентрация, за да се намери най-добрата комбинация от праймер и сонда.
Бележки
1.UNG ензимът може да се използва за отстраняване на замърсените продукти на dUTP амплификация от реакционната система преди реакцията на PCR амплификация, след което за избягване на фалшиво положителни резултати поради замърсяване на продукта.
2.Оптималната температура за UNG ензим, който да се използва в PCR реакцията против замърсяване, обикновено е 50 ℃ за 2 минути;състоянието на инактивиране е 95 ℃ за 5 минути.
3.Избягвайте честото замразяване-размразяване и не излагайте на големи температурни колебания.
4.Различните гени, които трябва да бъдат амплифицирани, имат различна ефективност на използване на dUTP и чувствителност към UNG ензима, следователно, ако използването на UNG система води до намаляване на чувствителността на откриване, реакционната система трябва да бъде коригирана и оптимизирана, ако имате нужда от техническа поддръжка, моля, свържете се нашата компания.
