Рназа инхибитор
Миши RNase инхибитор е рекомбинантен миши RNase инхибитор, експресиран и пречистен от E.coli.Той се свързва с РНКаза A, B или C в съотношение 1:1 чрез нековалентно свързване, като по този начин инхибира активността на трите ензима и предпазва РНК от разграждане.Той обаче не е ефективен срещу РНКаза 1, РНКаза Т1, S1 нуклеаза, РНКаза Н или РНКаза от Aspergillus.Инхибиторът на миша РНКаза беше тестван чрез RT-PCR, RT-qPCR и IVT иРНК и беше съвместим с различни търговски обратни транскриптази, ДНК полимерази и РНК полимерази.
В сравнение с инхибиторите на човешката РНКаза, инхибиторът на мишата РНКаза не съдържа два цистеина, които са силно чувствителни към окисление, което причинява инактивиране на инхибитора.Това го прави стабилен при ниски концентрации на DTT (по-малко от 1 mM).Тази характеристика го прави подходящ за използване при реакции, при които високите концентрации на DTT са неблагоприятни за реакцията (напр. RT-PCR в реално време).
Aприложение
Този продукт може да се използва широко във всеки експеримент, при който е възможна интерференция с РНКаза, за да се избегне разграждането на РНК, като например:
1.Синтез на първата верига на кДНК, RT-PCR, RT-qPCR и др.
2.Защитава РНК от разграждане по време на in vitro транскрипция/транслация (напр. in vitro вирусна репликационна система).
3.Инхибиране на активността на РНКаза по време на разделяне и пречистване на РНК.
Условия за съхранение
Продуктът може да се съхранява при -25～- 15 ℃, валиден 2 години.
Буфер за съхранение
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (рН 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT и 50% глицерол.
Дефиниция на единица
Количеството инхибитор на миша РНКаза, необходимо за инхибиране на активността на 5 ng рибонуклеаза А с 50%, се определя като една единица (U).
Молекулно тегло на протеина
Молекулното тегло на инхибитора на миша РНКаза е 50 kDa.
Контрол на качеството
Екзонуклеаза Дейност:
40 U инхибитор на миша РНКаза с 1 μg λ -Hind III смляна ДНК при 37 ℃ за 16 часа не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.
Ендонуклеазна активност:
40 U инхибитор на миша РНКаза с 1 μ g λ ДНК при 37 ℃ за 16 часа не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.
Нарязване Дейност:
40U инхибитор на миша РНКаза с 1 μ g pBR322 при 37 ℃ за 16 часа не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.
РНКаза Дейност:
40U инхибитор на миша РНКаза с 1,6 μ g MS2 РНК за 4 часа при 37 ℃ не води до разграждане, както е определено чрез електрофореза в агарозен гел.
E.coli ДНК:
40 U инхибитор на миша РНКаза се изследва за наличие на геномна ДНК на Е. coli, използвайки TaqMan qPCR с праймери, специфични за локуса на 16S rRNA на E. coli.Замърсяването на геномна ДНК на E. coli е ≤ 0,1 pg/40 U.
Nбележкаs
1. Силните колебания или разбъркване ще доведат до инактивиране на ензима.
2. Оптималният температурен диапазон на този инхибитор е 25-55 ℃ и той е инактивиран при 65 ℃ и повече.
3. Активностите на РНКаза Н, РНКаза 1 и РНКаза Т1 не се инхибират от миши РНКазен инхибитор.
4. Инхибирането на активността на РНКазата се установява в широк диапазон на рН (всички рН 5-9 са активни), а най-висока активност се наблюдава при рН 7-8.
5. Тъй като рибонуклеазите обикновено запазват активност при условия на денатуриране, трябва да се внимава да се избегне денатуриране на молекули на инхибитор на РНКаза, които са образували комплекс с рибонуклеаза.За да се предотврати освобождаването на активна рибонуклеаза, трябва да се избягват температури над 50 °C и високи концентрации на урея или други денатуриращи агенти.
