RTL обратна транскриптаза
RTL обратната транскриптаза е зависима от РНК матрица ДНК полимераза, на която липсва 3'→5' екзонуклеазна активност и има активност на РНКаза Н.Този ензим може да използва РНК като матрица за синтезиране на комплементарна верига на ДНК, която може да се приложи за синтез на сДНК на първата верига, особено за RT-LAMP (изотермична амплификация, медиирана от бримка).В сравнение с RTL обратната транскриптаза 1.0, чувствителността е значително подобрена, термичната стабилност е по-силна и реакцията при 65°C е по-стабилна.RTL обратната транскриптаза (без глицерол) може да се използва за приготвяне на лиофилизирани препарати, лиофилизирани RT-LAMP реагенти и др.
Определение на единица
Една единица включва 1 nmol dTTP в киселинно утаен материал за 20 минути при 50°C, използвайки поли(А)•олиго(dТ)25 като шаблонен праймер.
Компоненти
| Компонент | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL обратна транскриптаза (без глицерол) (15U/μL) | 0,1 мл | 1 мл | 10 мл |
| 10×HC RTL буфер | 1,5 мл | 4×1,5 мл | 5×10 мл |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 мл | 2×1,5 мл | 3×10 мл |
Условия на съхранение
Транспортиране под 0°C и съхранение при -25°C~-15°C.
Контрол на качеството
- Остатъчна активност наEндонуклеаза:Реакция от 50 μL, съдържаща 1 μg λDNA и 15 единици RTL2.0, инкубирана в продължение на 16 часа при 37 ℃, показва същия модел като отрицателната контрола чрез гел електрофореза.
- Остатъчна активност наЕкзонуклеаза:50 μL реакция, съдържаща 1 μg Hind Ⅲ смляна λDNA и 15 единици RTL2.0, инкубирана за 16 часа при 37 ℃, показва същия модел като отрицателната контрола чрез гел електрофореза.
- Остатъчна активност наNickase:Реакция от 50 μL, съдържаща 1 μg суперспирален pBR322 и 15 единици RTL2.0, инкубирана в продължение на 4 часа при 37°C, показва същия модел като отрицателната контрола чрез гел електрофореза.
- Остатъчна активност наРНКаза:Реакция от 10 μL, съдържаща 0,48 μg MS2 RNA и 15 единици RTL2.0, инкубирана в продължение на 4 часа при 37°C, показва същия модел като отрицателната контрола чрез гел електрофореза.
- E. coli gДНК:Измерено сE.coliспецифични комплекти за откриване на HCD，15 единици RTL2.0 съдържат по-малко от 1E. coliгеном.
Настройка на реакцията
cDNA протокол за синтез
| Компоненти | Сила на звука |
| Матрична РНК а | по желание |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) или Random Primer mix (60uM) | 2 μL |
| dNTP микс (10mM всеки) | 1 μL |
| РНКазен инхибитор (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL обратна транскриптаза 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL буфер | 2 μL |
| Вода без нуклеази | До 20 μL |
Бележки:
1) Препоръчваната дозировка на общата РНК е 1ng~1μg
2) Препоръчителната доза на иРНК е 50 ng~100 ng
Термо-колоездене Условия за рутина реакция:
| Температура (°C) | време |
| 25 °Ca | 5 минути |
| 55 °C | 10 минутиb |
| 80 °C | 10 минути |
Бележки:
1) Ако се използва Random Primer Mix, етап на инкубиране при 25°C.
2) Ако се използва смес от целеви праймери, етап на инкубиране при 55°C за 10~30 минути.
Протокол RT-LAMP
| Компоненти | Сила на звука | Крайна концентрация |
| Матрична РНК | по желание | ≥10 копия |
| dNTP смес (10mM) | 3,5 μL | 1,4 тМ |
| FIP/BIP праймери (25 ×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 Грундове (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB праймери (25 ×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Инхибитор на РНКаза (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Реакция |
| RTL обратна транскриптаза 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/реакция |
| Bst V2 ДНК полимераза (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Реакция |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μL | 6 mM (общо 8 mM) |
| 10×HC RTL буфер (или 10×HC Bst V2 буфер) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Вода без нуклеази | До 25 μL | - |
Бележки:
1) Смесете чрез завихряне и центрофугирайте за кратко, за да съберете.Инкубиране при постоянна температура при 65°C за 1 час.
2) Двата буфера са оперативно съвместими и имат еднакъв състав.
Бележки
1. Този продукт ще образува бяло твърдо вещество, когато се съхранява при -20 °C.Извадете го от -20°C и го поставете върху лед за около 10 минути.След разтопяване може да се използва чрез разклащане и смесване.
2. cDNA продуктът може да се съхранява при -20°C или -80°C или да се използва веднага за PCR реакция.
3. За да предотвратите замърсяване с РНКаза, моля, поддържайте експерименталната зона чиста и носете чисти ръкавици и маски по време на работа.
