Мини комплект за извличане на ДНК
Този комплект използва оптимизирана буферна система и технология за пречистване на колона със силикагел, която може да възстанови 70 bp – 20 kb ДНК фрагменти от различни концентрации на TAE или TBE агарозен гел.ДНК адсорбционната колона може специално да адсорбира ДНК при високо съдържание на сол.В допълнение, комплектът може директно да пречиства ДНК фрагменти от PCR продукти, ензимни реакционни системи или сурови ДНК продукти, получени по други методи, и да премахва примеси като протеини, други органични съединения, йони на неорганични соли и олигонуклеотидни праймери.Може да гарантира, че пречистването може да бъде завършено в рамките на 10-15 минути.Пречистената ДНК може да се използва директно за лигиране, трансформация, ензимно смилане, in vitro транскрипция, PCR, секвениране, микроинжектиране и др.
Условия за съхранение
Съхранявайте при -15 ~ -25 ℃ и транспортирайте при стайна температура.
Компоненти
| Компоненти | (100 rxns) |
| Буферен БВП | 80 мл |
| Буфер GW | 2 × 20 мл |
| Буфер за елуиране | 20 мл |
| Мини колони FastPure DNA-G | 100 |
Буферен БВП:ДНК свързващ буфер.
Буфер GW:Измиващ буфер;добавете абсолютен етанол до указания обем върху бутилката преди употреба.
Буфер за елуиране:Елуиране.
Мини колони FastPure DNA-G:ДНК адсорбционни колони.
Епруветки за събиране 2 ml:Събирателни тръби за филтрат.
Подготвени материали
1,5 ml стерилизирани епруветки, абсолютен етанол и изопропанол (когато ДНК фрагмент ≤100 bp, добавете 1 обем
изопропанол към 1 обем гел), водна баня.
Експериментален процес
Добавете 80 ml етанол за разреждане на буфер GW, както е посочено на етикета преди употреба, съхранявайте на стайна температура.
Механизъм
1. PCR реакционен разтвор
Схема за гел екстракция: Добавяне на равен обем буфер GDP PCR реакционен разтвор Схема за възстановяване:Добавете 5 пъти обемния буфер
2. БВП Изчислете обема на гела (100 μl е равно на 100 mg )
Разтворете гела
3. Загрейте предварително на 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Добавете 300 μL буфер GDP*
Добавете 700 μL буфер GW
Добавете 700 μL буфер GW
5. Елуиране
Добавете 20 – 30 μL елуиращ буфер или дейонизирана вода
Бележки* Възстановяване на PCR реакционна течност без тази стъпка
Програма за извличане на гел
1. След ДНК електрофореза за фракциониране на ДНК фрагменти, изрежете единичната ивица ДНК фрагмент от агарозния гел под UV светлина.Препоръчително е да използвате абсорбираща хартия, за да абсорбирате видимата влага от гела и да минимизирате размера на парчето гел, като премахнете допълнителната агароза, доколкото е възможно.Претеглете парчето гел (без микроцентрофужната епруветка), за да изчислите неговия обем: Обемът на парчето гел от 100 mg е приблизително 100 μL, като се приеме, че плътността е 1 g/ml.
2. Добавете равен обем буфер GDP, инкубирайте при 50~55 ℃ за 7-10 минути (според размера на гела, коригирайте времето за инкубация, докато гелът се разтвори напълно).Обърнете епруветката 2 пъти по време на инкубацията.
Δ Добавянето на 1-3 обема буфер GDP няма да повлияе на ефективността на възстановяване на ДНК.Ако ДНК фрагментът, който трябва да бъде възстановен <100 bp, трябва да се добавят 3 обема буфер GDP;когато парчето гел се разтвори напълно, добавете 1 обем изопропанол и разбъркайте добре, след което продължете към следващата стъпка.
3. Центрофугирайте за кратко, за да доведете пробата до дъното на епруветката, поставете FastPure DNA Mini Columns-G в епруветките за събиране от 2 ml, внимателно прехвърлете разтвора от максимум 700 μL веднъж на
време до филтрационните колони, центрофугирайте при 12 000 rpm (13 800 X g) за 30-60 сек.
4. Изхвърлете филтрата и добавете 300 μL буфер GDP към колоната, инкубирайте при стайна температура за 1 минута, центрофугирайте при 12 000 rpm (13 800 X g) за 30-60 секунди.
5. Изхвърлете филтрата и добавете 700 μL буфер GW (проверете дали е добавен абсолютен етанол предварително!) към колоната, центрофугирайте при 12 000 rpm (13 800 X g) за 30-60 секунди.
Δ Моля, добавете буфер GW около стената на адсорбционната колона или добавете задния капак на буфер GW и го разбъркайте с главата надолу 2 – 3 пъти, за да помогнете за пълното промиване на солта, полепнала по стената на тръбата.
6. Повторете стъпка 5.
Δ Промиването с буфер GW два пъти може да гарантира, че солта е напълно отстранена и да елиминира въздействието върху следващите експерименти.
7. Изхвърлете филтрата и центрофугирайте празната колона при 12 000 rpm (13 800 X g) за 2 минути.
8. Поставете колоната в чиста микроцентрофужна епруветка от 1,5 ml, добавете 20 - 30 μL елуиращ буфер към центъра на мембраната на колоната, инкубирайте за 2 минути и след това центрофугирайте при 12 000 rpm (13 800 X g) за 1 минута.Изхвърлете колоната, съхранете получената ДНК при -20°С.
Δ Прехвърлянето на супернатанта от стъпка 8 в колоната за повторно елуиране и предварителното загряване на буфера за елуиране до 55 (когато ДНК фрагмент >3 kb) може да е от полза за повишаване на ефективността на възстановяване.
Програма за възстановяване на PCR продукти
Този протокол е приложим за пречистване на ДНК фрагменти от PCR продукти, ензимна реакционна система и други необработени ДНК продукти (включително генетична ДНК).Този разтвор може ефективно да отстрани различни нуклеотиди, праймери, праймери, солеви молекули, ензими и други примеси.
1. Центрофугирайте за кратко PCR продукти, разтвор за ензимна реакция и други сурови ДНК продукти.Измерете обема им с пипета и прехвърлете в стерилизирана епруветка от 1,5 ml или 2 ml.Добавете ddH2O до достигане на обем до 100 μL;докато за геномна ДНК с висока концентрация, разреждането до 300 μL с ddH2O ще помогне за подобряване на ефективността на възстановяване.
2. Добавете 5 обема буфер GDP, разбъркайте старателно чрез обръщане или вортексиране.Ако интересуващият се ДНК фрагмент >100 bp, трябва да се добавят допълнителни 1,5 обема (проби + буфер GDP) етанол.
3. Поставете колоната обратно в епруветката за събиране, прехвърлете сместа в колоната, центрофугирайте при 12 000 rpm (13 800 × g) за 30 – 60 секунди.Ако обемът на смесения разтвор е >700 µL, поставете адсорбционната колона обратно в епруветката за събиране, прехвърлете останалия разтвор в адсорбционната колона и центрофугирайте при 12 000 rpm (13 800 × g) за 30 – 60 секунди.
4. Следващото изпълнение се отнася за стъпка 5 – 8 от 08-1/Програма за екстракция на гел.
Приложения
Различни концентрации на TAE или TBE агарозен гел;PCR продукти, ензимни реакционни системи или други необработени ДНК продукти, получени по различни методи.Възстановените фрагменти варират от70 bp -20 kb.
Бележки
Само за изследователска употреба.Не се използва при диагностични процедури.
1. Добавете 80 ml етанол, за да разредите буфера GW, както е посочено на етикета, преди употреба, съхранявайте на стайна температура.
2. Ако буферният GDP лесно се утаява по време на съхранение при ниска температура, той може да се постави на стайна температура за определен период от време преди употреба.Ако е необходимо, може да се загрее предварително на 37 ℃ водна баня, докато утайката се разтвори напълно, и след това може да се използва след смесване.
3. Задайте температурата на водната баня на 50 ~55 ℃ предварително.
4. В 08-1/Стъпка 1 на програмата за екстракция на гел минимизирането на размера на парчето гел ще намали значително времето за разтваряне и ще увеличи ефективността на възстановяване (линеаризираната ДНК лесно се хидролизира, когато е изложена непрекъснато на висока температура).Не излагайте ДНК гела на UV за дълго време, тъй като ултравиолетовата светлина може да причини увреждане на ДНК.
5. Разтворете напълно гела в 08-1/Стъпка 2 на програмата за екстракция на гел, в противен случай ефективността на възстановяване на ДНК ще бъде сериозно засегната.
6. Загрейте предварително буфера за елуиране или ddH2O до 55 ℃, което е полезно за подобряване на ефективността на елуиране на ДНК.Препоръчва се ДНК да се съхранява в елуент от 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
