Hotstart Taq ДНК полимераза
Taq ДНК полимераза с горещ старт (модификация на антитяло) е термостабилна ДНК полимераза с горещ старт от Thermus aquaticus YT-1, която притежава 5′→3′ полимеразна активност и 5´ клапна ендонуклеазна активност.Taq ДНК полимеразата с горещ старт е Taq ДНК полимераза, която е модифицирана от термолабилни Taq антитела.Модификацията на антитялото повишава специфичността, чувствителността и добива на PCR.
Компоненти
| Компонент | HC1012А-01 | HC1012А-02 | HC1012А-03 | HC1012А-04 |
| 5×HC Taq буфер | 4×1 мл | 4×10 мл | 4×50 мл | 5 × 400 мл |
| Hot Start Taq ДНК полимераза (модифицирана с антитяло) (5 U/μL) | 0,1 мл | 1 мл | 5 мл | 10 × 5 мл |
Приложения
10 mM Tris-HCl (рН 7,4 при 25°C), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM дитиотреитол, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 и 50% глицерол.
Условия на съхранение
Транспортиране под 0°C и съхранение при -25°C~-15°C.
Определение на единица
Една единица се определя като количеството ензим, което включва 15 nmol dNTP в неразтворим в киселина материал за 30 минути при 75°C.
Контрол на качеството
1.Endonuclease активност:Инкубирането на 20 U ензим с 4 μg pUC19 ДНК в продължение на 4 часа при 37 °C не доведе до откриваемо разграждане на ДНК, както е определено чрез гел електрофореза.
2.5 kb ламбда PCR:25 цикъла на PCR амплификация на 5 ng ламбда ДНК с 1,25 единици Taq ДНК полимераза в присъствието на 200 µM dNTPs и 0,2 µM праймери води до очаквания 5 kb продукт.
3.Екзонуклеазна активност:Инкубирането на 50 µl реакция, съдържаща минимум 12,5 U Taq ДНК полимераза с 10 nmol 5´-FAM олигонуклеотид за 30 минути при 37 ℃, не води до откриваемо разграждане.
4.РНКазна активност:Инкубирането на 10 µL реакция, съдържаща 20 U ензим с 1 μg РНК транскрипти в продължение на 2 часа при 37°C, не доведе до откриваемо разграждане на РНК, както е определено чрез гел електрофореза.
5.Топлинно инактивиране:Не.
Реакционна система
| Компоненти | Сила на звука |
| Шаблонна ДНКa | по желание |
| 10 μM преден праймер | 0,5 μL |
| 10 μM обратен праймер | 0,5 μL |
| dNTP микс (10mM всеки) | 0,5 μL |
| 5×HC Taq буфер | 5 μL |
| Taq ДНК полимеразаb(5U/μL) | 0,125 μL |
| Вода без нуклеази | До 25 μL |
Бележки:
1) а.
| ДНК | Количество |
| Геномни | 1 ng-1 μg |
| Плазмид или вирус | 1 pg-1 ng |
2) б.Оптималната концентрация на Taq ДНК полимераза може да варира от 5-50 единици/mL (0,1-0,5 единици/25 µL реакция) в специализирани приложения.
Протокол за термичен цикъл
PCR
| стъпка | температура(°C) | време | Цикли |
| Първоначална денатурацияa | 95 ℃ | 1-3мин | - |
| Денатурация | 95 ℃ | 15-30 с | 30-35 цикъла |
| Отгряванеb | 45-68 ℃ | 15-60 с | |
| Разширение | 68 ℃ | 1kb/мин | |
| Окончателно разширение | 68 ℃ | 5 минути | - |
Бележки:
1) Първоначална денатурация от 1 минута при 95°C е достатъчна за повечето амплификации.За трудни шаблони се препоръчва по-дълга денатурация от 2-3 минути при 95°C.При PCR на колония се препоръчва първоначална денатурация от 5 минути при 95°C.
2) Етапът на отгряване обикновено е 15-60 s.Температурата на отгряване се основава на Tm на двойката праймери и обикновено е 45-68 ℃.
