Директен PCR комплект за растенията

Каталожен номер: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit е подходящ за директна амплификация на листа от растения, семена и др. и може да се използва за високопроизводителен скрининг на растителни проби, които не съдържат полизахариди и полифеноли.Директната амплификационна ДНК полимераза, базирана на насочената еволюция, има превъзходна толерантност към PCR инхибиторите в растенията.Междувременно той поддържа висока производителност на амплификация, която е подходяща за амплификация на ДНК фрагменти в рамките на 5 kb.Уникалният лизиращ буфер А в комплекта може да се използва за лизиране на пресни или замразени растителни тъкани.Той е лесен за работа и лизатът може да се използва като шаблон за амплификация без пречистване.Системата съдържа защитни агенти, които позволяват суровите проби да бъдат ефективно амплифицирани след многократно замразяване и размразяване.2 × Plant Direct Master Mix трябва само да добави праймери и шаблони, за да извърши реакция на усилване, като по този начин намалява операциите по пипетиране и подобрява производителността на откриване и възпроизводимостта на резултатите.

Компоненти

*Plant Direct Lysis Buffer B е допълнителен реагент, който се използва за неутрализиране на Plant Direct Lysis Buffer A за удължаване на времето за съхранение на пробите.Може да се използва според реалната ситуация.

Условия за съхранение

2 × Plant Direct Master Mix, съхранявайте при -30 ~ -15 ℃ и избягвайте повторно замразяване и размразяване;Буфер за директен лизис на растенията, съхранявайте при -30 ~ -15 ℃ или 2 ~ 8 ℃.

Експериментален процес

Обработка на проби–Лист на растението

Директен метод:Препоръчително е да се използват млади листа.Използвайте перфоратор с фиксиран диаметър от 0,5 – 3 mm, за да получите малка и еднаква проба, след което директно добавете пробата към PCR системата (препоръчва се система от 50 μl).Забележете, уверете се, че пробата е в PCR разтвора, а не до стената на епруветката.Ако се използва директен PCR за амплифициране на дълги фрагменти и сложни проби, използването на проба с по-малък диаметър (0,5 – 1 mm) като шаблон може да помогне за получаване на по-добри резултати.

Метод на смилане на лизис:Препоръчително е да се използват млади листа.Вземете малко парче лист (около 1 – 3 mm в диаметър), поставете го в 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab и го смилайте колкото е възможно повече (тази стъпка може да се направи чрез изстискване на листа с върха на пипета от 100 μl за пасиране на пробата).Ако се използват по-големи обеми листна тъкан (не надвишават 7 mm), увеличете обема на буфера за разреждане до 50 μl.След като листата се смелят, разтворът трябва да изглежда зелен.След кратко центрофугиране добавете 1 μl от супернатанта към PCR системата като реакционна матрицаc.

Метод на термичен лизис:Препоръчително е да се използват млади листа.Вземете малко парче лист (около 1 – 3 mm в диаметър), поставете го в 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A и го загрейте при 95°C за 5 – 10 минути.Времето за лизиране може да бъде подходящо удължено за листа, които са трудни за лизиране (не повече от 20 минути).Ако се използват по-големи обеми листна тъкан (не надвишават 7 mm), увеличете обема на буфера за разреждане до 50 μl.След нагряване, центрофугирайте за кратко и добавете 1 μl супернатанта към PCR системата като реакционна матрицаb.

Обработка на проби– семена на растения

Метод на смилане на лизис:Използвайте скалпел, за да изрежете семена с диаметър 5 mm, добавете ги към 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A и смелете пробата с върха на пипета или други инструменти.Разбъркайте за кратко и оставете да престои на стайна температура за 3 – 5 минути.Уверете се, че пробата от семена е потопена в буфера за разреждане.След кратко центрофугиране добавете 1 μl от супернатанта към PCR системата като реакционна матрица.

Метод на термичен лизис:Използвайте скалпел, за да изрежете семена с диаметър 5 mm, добавете ги към 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A и загрейте при 95°C за 5 – 10 минути.Времето за лизиране може да бъде подходящо удължено за листа, които са трудни за лизиране (не повече от 30 минути).След нагряване центрофугирайте за кратко и добавете 1 μl супернатанта към PCR системата като реакционен шаблонb.

а.Ножици или други инструменти също могат да се използват за изрязване на проби с подходящ размер;ако перфораторът или ножицата се използват повторно, те трябва да се почистват с 2% разтвор на натриев хипохлорит преди всяка употреба, за да се предотврати кръстосано замърсяване между пробите.

b.Уверете се, че буферът за директен лизис на растенията е напълно разтопен преди употреба.Ако буферът е вискозен или има утайки, той може да се нагрее до 37 ℃, за да се разтопи напълно преди употреба.

° С.Обемът на матрицата в реакционната система може да се регулира по подходящ начин според разликата в обема на добавения растителен материал и разредител.

Буфер за директен лизис на растенията

Буферът А за директен лизис на растенията, съдържащ се в този продукт, е стриктно оптимизиран за освобождаване на генома на повечето растителни тъкани и е подходящ за краткосрочно съхранение на сурови растения при 4 ℃.Ако пробата трябва да се съхранява за по-дълъг период от време (напр. 1 – 2 месеца), се препоръчва супернатантата да се прехвърли в нова EP епруветка и да се съхранява при -20 ℃.За да съхраните пробите по-стабилно, добавете равен обем Plant Direct Lysis Buffer B към прехвърления супернатант, разбъркайте добре и съхранявайте при -20℃.Времето за стабилно съхранение варира в зависимост от растителните проби и състояния.

Реакционна система

а.Съдържа Mg²⁺при крайна концентрация от 2 тМ.

b.Препоръчва се да се използва крайна концентрация от 0,4 μM за всеки праймер.Прекомерната употреба на праймери ще доведе до повишена неспецифична амплификация.

° С.Количеството на използваната проба може да се коригира според действителната ситуация.Количеството, използвано в една реакция на сурова лизирана проба, може да се регулира между 2% – 20% от общия обем на реакцията.Използването на твърде много проби може да причини неуспешно усилване.

Програма за реакция

а.Първоначалната денатурация (98 ℃, 5 минути) насърчава лизис на растителна тъкан, освобождавайки геномна ДНК, която може да се използва за PCR амплификация.Не съкращавайте времето и не намалявайте температурата.

b.Препоръчва се да се зададе равно на стойността на Tm на праймера или 2 ~ 4 ℃ по-висока от стойността на Tm.ДНК полимеразата за директно усилване, използвана в този продукт, е различна от конвенционалната Taq ДНК полимераза и има специални изисквания за температурата на реакционно отгряване; използването на висока температура на отгряване може ефективно да намали неспецифичното усилване и да подобри ефективността на усилване.За сложни шаблони ефективното усилване може да се постигне чрез регулиране на температурата на отгряване и удължаване на времето за удължаване.

° С.Ако дължината на амплификационния продукт е ≤1 kb, времето за удължаване е зададено на 30 sec/kb;ако дължината на амплификационния продукт е >1 kb, времето за удължаване е зададено на 60 sec/kb.

д.За сложни проби или проби с нисък добив на усилване, броят на циклите може да бъде подходящо увеличен до 40 -50 цикъла.

Приложения

Приложим е за директна амплификация на растителни тъкани и високопроизводителен скрининг на растителни проби, които не съдържат полизахариди и полифеноли.

Бележки

Само за изследователска употреба.Не се използва при диагностични процедури.

1. За необработена растителна амплификация или директна амплификация се препоръчва да се използва пречистена геномна ДНК като положителна контрола преди започване на експеримента, за да се гарантира, че системата, праймерите и операциите са правилни.

2. ДНК полимеразата за директно усилване, използвана в този комплект, има силна коригираща активност.Ако трябва да се извърши TA клониране, се препоръчва пречистване на ДНК преди добавяне на аденин.

3. Ръководство за проектиране на грунд:

а.Препоръчва се последната основа в 3' края на праймера да бъде G или C.

b.Трябва да се избягват последователни несъответствия в последните 8 бази в 3' края на праймера.° С.Избягвайте фиби структури в 3' края на грунда.

д.Разликите в стойността на Tm на предния праймер и обратния праймер трябва да бъдат не повече от 1 ℃ и стойността на Tm трябва да се коригира на 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 се препоръчва за изчисляване на стойността на Tm).

д.Допълнителни допълнителни праймерни последователности, които не съответстват на шаблона, не трябва да се включват при изчисляване на стойността на праймера Tm.

f.Препоръчително е GC съдържанието на грунда да бъде 40% -60%.

ж.Общото разпределение на A, G, C и T в грунда трябва да бъде възможно най-равномерно.Избягвайте използването на региони с високо съдържание на GC или AT.

ч.Избягвайте присъствието на комплементарни последователности от 5 или повече бази в праймера или между два праймера и избягвайте присъствието на комплементарни последователности от 3 или повече бази в 3' края на два праймера.

азИзползвайте функцията NCBI BLAST, за да проверите специфичността на праймера, за да предотвратите неспецифично усилване.