2×Sensi Direct Premix-UNG (проба qPCR)
Каталожен номер: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) е проектиран да извършва PCR директно от проби без екстракция на ДНК или подготовка на проби.Този реагент се състои от ДНК полимераза с горещ старт, урацил ДНК гликозилаза (UNG), РНКазен инхибитор, MgCl2, dNTP (с dUTP вместо dTTP) и стабилизатори за количествена PCR (qPCR).Този реагент предварително формира висока инхибиторна толерантност и по този начин може да се прилага директно за откриване на проби като тампон от гърло, слюнка, антикоагулирана цяла кръв, плазма и серум без екстракция на ДНК.Реагентът използва патентован буфер за qPCR със смесени ензими от антиинхибиторна ДНК полимераза и UNG ензим.Следователно, той може да получи добра амплификация на целевите гени в проби, съдържащи инхибитори, и да инхибира фалшиво положителното усилване, причинено от PCR остатъчно и аерозолно замърсяване.Този реагент е съвместим с повечето флуоресцентни количествени PCR инструменти, като Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche и т.н.
Компоненти
1. 50 × SensiDirect Ензим/UNG микс
2. 2×SensiDirect буфер за предварително смесване (dUTP)
Условия за съхранение
Всички компоненти трябва да се съхраняват при -20 ℃ за дългосрочно съхранение и 4 ℃ до 3 месеца.Моля, разбъркайте добре след размразяване и центрофугирайте преди употреба.Избягвайте честото замразяване-размразяване.
Протокол за колоездене
| стъпка | температура | време | Цикъл |
| Храносмилане | 50 ℃ | 2 мин | 1 |
| Активиране на полимераза | 95 ℃ | 1-5 мин | 1 |
| Денатуриране | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 |
| Отгряване/удължаване | 56-64 ℃ | 20-60-те години |
Инструкции за пипетиране
| реагент | Обем на реакция | Обем за реакция | Крайна концентрация |
| 2×SensiDirect буфер за предварително смесване (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 50 × SensiDirect Ензим/UNG микс | 0,5 µL | 1µL | 1× |
| 25×Смес праймер-сонда12 | 1µL | 2µL | 1× |
| проба3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Общ обем | 25 μL | 50 μL | - |
1. Крайната концентрация на праймера обикновено е 0,2 μM.За по-добри резултати концентрацията на праймера може да бъде оптимизирана в диапазона от 0,2-1 μM.
2. Като цяло концентрацията на сондата може да бъде оптимизирана в диапазона от 0,1-0,3 μM.Оптималната концентрация на сондата е свързана с инструмента за PCR амплификация в реално време, вида на сондата и вида на флуоресцентното белязващо вещество.Моля, вижте ръководството за инструмента или специфичните изисквания за всяка флуоресцентна сонда.
3. Различните видове проби съдържат различни видове и съдържание на инхибитор и брой копия на целевия ген.Обемът на пробата трябва да се разглежда според действителното състояние.Направете разреждане на пробата, като добавите вода без нуклеаза или TE буфер, ако е необходимо.
4. Препоръчителен обем на различни проби:
| проба | Обем за един 50 μL реакция | Максимум съотношение |
| Антикоагулирана цяла кръв | 2,5 μL | 5% |
| плазма | 15 μL | 30% |
| Серум | 10 μL | 20% |
| Тампон от гърлото | 10 μL | 20% |
| слюнка | 10 μL | 20% |
Контрол на качеството
1. Функционално откриване: чувствителност, специфичност и повторяемост на qPCR.
2. Без екзогенна нуклеазна активност: без екзогенна ендонуклеаза и замърсяване с екзонуклеаза.
Бележки за продукта
1. Този продукт използва нов тип ДНК полимераза с горещ старт, която може да се активира за 1-5 минути. Тъй като неговият реакционен буфер е оптимизиран, той е по-подходящ за двойна или множествена флуоресцентна количествена PCR с използване на метод на сонда.
2. Ако Rn стойността на PCR амплификацията е твърде ниска или амплификацията е очевидно инхибирана, намаляването на количеството на пробата, увеличаването на реакционния обем или предишното разреждане на пробата може да подобри резултатите.
3. Вземането на кръв, слюнка, урина, гърлен секрет и т.н. трябва да следва изискванията на клиничните критерии и може да се използва прясна проба за предотвратяване на разграждането на нуклеинова киселина.
4. Тъй като различните ампликони имат различна ефективност на използване спрямо dUTP и чувствителност към UNG, реагентите трябва да бъдат оптимизирани, ако чувствителността на откриване намалее при използване на UNG система.Моля, свържете се с нас за техническа поддръжка, ако е необходимо.
5. За да се избегне амплификацията на остатъчните PCR продукти между едноетапните реакции, за амплификацията са необходими специална експериментална зона и пипета.Работете с ръкавици и ги сменяйте често и не отваряйте реакционната епруветка след PCR амплификация.
