Протеиназа K NGS (прах)
Каталожен номер: HC4507A
NGS протеаза K е стабилна серинова протеаза с висока ензимна активност и широка субстратна специфичност. Ензимът преференциално разлага естерни връзки и пептидни връзки в съседство с С-края на хидрофобни аминокиселини, сяросъдържащи аминокиселини и ароматни аминокиселини.Така че често се използва за разграждане на протеини в къси пептиди.NGS протеаза K е типична серинова протеаза с Asp39-Неговата69-сер224каталитична триада, която е уникална за сериновите протеази, а каталитичният център е заобиколен от Ca2+свързващи места за стабилизиране, поддържане на висока ензимна активност при по-широк диапазон от условия.
Спецификация
| Външен вид | Бял до почти бял аморфен прах, лиофилизиран |
| Специфична дейност | ≥40U/mg твърдо вещество |
| ДНКаза | Няма открити |
| РНКаза | Няма открити |
| Биотовар | ≤50CFU/g твърдо вещество |
| Остатък от нуклеинова киселина | <5 pg/mg твърдо вещество |
Имоти
| Източник | Tritirachium албум |
| EC номер | 3.4.21.64(Рекомбинант от Tritirachium album) |
| Молекулно тегло | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Изоелектрична точка | 7.81 Фиг.1 |
| Оптимално pH | 7,0-12,0 (Всички имат висока активност) Фиг.2 |
| Оптимална температура | 65℃ Фиг.3 |
| pH стабилност | pH 4,5-12,5 (25℃, 16h) Фиг.4 |
| Термична стабилност | Под 50 ℃ (pH 8,0, 30 минути) Фиг.5 |
| Стабилност при съхранение | Съхранява се при 25 ℃ в продължение на 12 месеца Фиг.6 |
| Активатори | SDS, урея |
| инхибитори | Диизопропил флуорофосфат;бензилсулфонил флуорид |
Условия за съхранение
Съхранявайте лиофилизирания прах при -25~-15 ℃ за дълго време далеч от светлина;След разтваряне разпределете аликвотна част в подходящ обем за краткосрочно съхранение при 2-8 ℃ далеч от светлина или дългосрочно съхранение при -25~-15 ℃ далеч от светлина.
Предпазни мерки
Носете защитни ръкавици и очила, когато използвате или претегляте, и дръжте добре проветрен след употреба.Този продукт може да причини кожна алергична реакция и сериозно дразнене на очите.При вдишване може да причини симптоми на алергия или астма или диспнея.Може да причини дразнене на дихателните пътища.
Дефиниция на единица
Една единица NGS протеаза K се определя като количеството ензим, необходимо за хидролизиране на казеина в 1 μmol L-тирозин при стандартни условия на определяне.
Приготвяне на реактиви
| реагент | производител | Каталог |
| Казеин техническиот краве мляко | Сигма Олдрич | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Трихлороцетна киселина | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Натриев ацетат | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Оцетна киселина | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| НС1 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Натриев карбонат | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Фолин-фенол | Sangon Biotech (Шанхай)ООД. | A500467-0100 |
| L-тирозин | Сигма | 93829 |
Реактив I:
Субстрат: 1% казеин от разтвор на говеждо мляко: разтворете 1 g казеин от говеждо мляко в 50 ml 0,1 М разтвор на натриев фосфат, рН 8,0, загрейте във водна баня при 65-70 °C за 15 минути, разбъркайте и разтворете, охладете с вода, коригирана с натриев хидроксид до pH 8,0 и се разрежда до 100 ml.
Реагент II:
Разтвор на TCA: 0.1M трихлороцетна киселина, 0.2M натриев ацетат и 0.3M оцетна киселина (претеглят се последователно 1.64g трихлороцетна киселина + 1.64g натриев ацетат + 1.724mL оцетна киселина, добавят се 50mL дейонизирана вода, регулира се с HCl до pH 4.03 и се разрежда в 100 мл).
Реактив III:
0,4 ml разтвор на натриев карбонат (претеглят се 4,24 g безводен натриев карбонат и се разтварят в 100 ml вода)
Реактив IV:
Фолинов фенолен реагент: разредете 5 пъти с дейонизирана вода.
Реактив V:
Ензимен разредител: 0,1 М разтвор на натриев фосфат, рН 8,0.
Реактив VI:
Стандартен разтвор на L-тирозин: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-тирозин, разтворен с 0,2 М НС1.
Процедура
1. Включете UV-Vis спектрофотометъра и изберете фотометрично измерване.
2. Задайте дължината на вълната като 660nm.
3. Включете водната баня, задайте температурата на 37 ℃, уверете се, че температурата не се променя за 3-5 минути.
4. Загрейте предварително 0,5 ml субстрат в 2 ml центрофужна епруветка при 37 ℃ водна баня за 10 минути.
5. Екстрахирайте 0,5 ml разреден ензимен разтвор в предварително загрятата центрофужна епруветка за 10 минути.Задайте ензимен разредител като празна група.
6. Добавете 1,0 mL TCA реагент веднага след реакцията.Разбъркайте добре и инкубирайте във водна баня за 30 минути.
7. Центрофугирайте реакционния разтвор.
8. Добавете следните компоненти в посочения ред.
| реагент | Сила на звука |
| Супернатант | 0,5 мл |
| 0.4M натриев карбонат | 2,5 мл |
| Фолинов фенолен реактив | 0,5 мл |
9. Разбъркайте добре, преди да инкубирате във водна баня при 37 ℃ за 30 минути.
10. OD660е определена като ОД1;празна контролна група: Ензимен разредител се използва за заместване на ензимния разтвор за определяне на OD660като OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Стандартна крива на L-тирозин: 0,5 mL разтвор на L-тирозин с различна концентрация, 2,5 mL 0,4 M натриев карбонат, 0,5 mL фолинов фенолен реагент в 5 mL центрофужна епруветка, инкубирайте при 37 ℃ за 30 минути, детектирайте за OD660за различна концентрация на L-тирозин, след което се получава стандартната крива Y=kX+b, където Y е концентрацията на L-тирозин, X е OD600.
Изчисляване
2: Общ обем на реакционния разтвор (mL)
0,5: Обем на ензимния разтвор (mL)
0,5: Обем на реакционната течност, използван при хромогенно определяне (mL)
10: Време за реакция (мин)
Df: Многократно разреждане
C: Ензимна концентрация (mg/mL)
Фигури
Фиг.1 ДНК остатък
| проба | Ave C4 | Нуклеинова киселина Възстановяване (pg/mg) | Възстановяване (%) | Общ нуклеинов киселина ( pg/mg) |
| PRK | 24,66 | 2.23 | 83% | 2,687 |
| PRK+STD2 | 18,723 | 126,728 | — | — |
| STD1 | 12,955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26,625 | |||
| H2O без РНК | Неопределен | — | — | — |
Фиг.2 Оптимално pH
Фиг.3 Оптимална температура
Фиг.4 pH стабилност
Фиг.5 Термична стабилност
Фиг.6 Стабилност при съхранение при 25 ℃
