Дива Taq ДНК полимераза
Taq ДНК полимераза е термостабилна ДНК полимераза от Thermus aquaticus YT-1, която притежава 5′→3′ полимеразна активност и 5´ клапна ендонуклеазна активност.
Компоненти
| Компонент | HC1010А-01 | HC1010А-02 | HC1010А-03 | HC1010А-04 |
| 10 × Taq буфер | 2×1 мл | 2×10 мл | 2×50 мл | 5×200 мл |
| Taq ДНК полимераза (5 U/μL) | 0,1 мл | 1 мл | 5 мл | 5×10 мл |
Условия на съхранение
Транспортиране под 0°C и съхранение при -25°C~-15°C.
Определение на единица
Една единица се определя като количеството ензим, което включва 15 nmol dNTP в неразтворим в киселина материал за 30 минути при 75°C.
Контрол на качеството
1.Тест за чистота на протеин (SDS-PAGE):Чистотата на Taq ДНК полимераза е ≥95%, определена чрез SDS-PAGE анализ.
2.Endonuclease активност:Минимум 5 U Taq ДНК полимераза с 1 μg λDNA за 16 часа при 37 ℃ не води до установено разграждане, както е определено.
3.Екзонуклеазна активност:Минимум 5 U Taq ДНК полимераза с 1 μg λ -Hind Ⅲ усвоена ДНК за 16 часа при 37 ℃ не води до откриваемо разграждане, както е определено.
4.Дейност на Nickase:Минимум 5 U Taq ДНК полимераза с 1 μg pBR322 ДНК за 16 часа при 37°C не води до установено разграждане, както е определено.
5.РНКазна активност:Минимум 5 U Taq ДНК полимераза с 1,6 μg MS2 РНК за 16 часа при 37°C не води до установено разграждане, както е определено.
6.E. coliДНК:5 U от Taq ДНК полимераза се изследват за наличие на геномна ДНК на E. coli, като се използва TaqMan qPCR с праймери, специфични за локуса на 16S rRNA на E. coli.Геномното ДНК замърсяване на E. coli е ≤1 копие.
7.PCR амплификация (5,0 kb ламбда ДНК)- Реакция от 50 µL, съдържаща 5 ng ламбда ДНК с 5 единици Taq ДНК полимераза за 25 цикъла на PCR амплификация, води до очаквания продукт от 5,0 kb.
Настройка на реакцията
| Компоненти | Сила на звука |
| Шаблонна ДНКa | по желание |
| 10 μM преден праймер | 1 μL |
| 10 μM обратен праймер | 1 μL |
| dNTP микс (10mM всеки) | 1 μL |
| 10 × Taq буфер | 5 μL |
| Taq ДНК полимеразаb | 0,25 μL |
| Вода без нуклеази | До 50 μL |
Бележки:
1) Оптималната реакционна концентрация на различните шаблони е различна.Следната таблица показва препоръчителната употреба на шаблон за 50 µL реакционна система.
| ДНК | Количество |
| Геномни | 1 ng-1 μg |
| Плазмид или вирус | 1 pg-1 ng |
2) Оптималната концентрация на Taq ДНК полимераза може да варира от 0,25 µL~1 µL в специализирани приложения.
реакцияпрограма
| стъпка | температура(°C) | време | Цикли |
| Първоначална денатурацияa | 95 ℃ | 5 минути | - |
| Денатурация | 95 ℃ | 15-30 с | 30-35 цикъла |
| Отгряванеb | 60 ℃ | 15 s | |
| Разширение | 72 ℃ | 1kb/мин | |
| Окончателно разширение | 72 ℃ | 5 минути | - |
Бележки:
1) Първоначалното състояние на денатурация е подходящо за повечето реакции на усилване и може да бъде модифицирано според сложността на структурата на шаблона.Ако структурата на шаблона е сложна, времето за предварителна денатурация може да бъде удължено до 5 – 10 минути, за да се подобри първоначалният ефект на денатурация.
2) Температурата на отгряване трябва да се регулира според стойността Tm на праймера, която обикновено е настроена на 3~5 ℃ по-ниска от стойността Tm на праймера;За сложни шаблони е необходимо да се регулира температурата на отгряване и да се удължи времето за удължаване, за да се постигне ефективно усилване.
