Протеиназа K mNGS (течна)
Протеиназа К е стабилна серинова протеаза с широка субстратна специфичност.Той разгражда много протеини в естествено състояние дори в присъствието на детергенти.Доказателства от изследвания на кристална и молекулярна структура показват, че ензимът принадлежи към семейството на субтилизините с каталитична триада на активно място (Asp39-Неговата69-сер224).Преобладаващото място на разцепване е пептидната връзка в съседство с карбоксилната група на алифатни и ароматни аминокиселини с блокирани алфа амино групи.Обикновено се използва поради широката си специфика.Тази протеиназа К е специално проектирана за mNGS.В сравнение с другата протеиназа К, тя съдържа още по-малко замърсяване с нуклеинова киселина със същата ензимна производителност, което би могло по-добре да осигури приложението на mNGS надолу по веригата.
Условия за съхранение
2-8 ℃ за 2 години
Спецификация
| Външен вид | Безцветна до светлокафява течност |
| Дейност | ≥800 U/ml |
| Концентрация на протеин | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Няма открити |
| ДНКаза | Няма открити |
| РНКаза | Няма открити |
Имоти
| EC номер | 3.4.21.64(Рекомбинант от Tritirachium album) |
| Изоелектрична точка | 7.81 |
| Оптимално pH | 7.0- 12.0 Фиг. 1 |
| Оптимална температура | 65 ℃ Фиг. 2 |
| pH стабилност | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 h) Фиг. 3 |
| Термична стабилност | Под 50 ℃ (рН 8,0, 30 минути) Фиг. 4 |
| Стабилност при съхранение | Над 90% активност за 12 месеца при 25 ℃ |
| Активатори | SDS, урея |
| инхибитори | Диизопропил флуорофосфат;фенилметилсулфонил флуорид |
Приложения
1. Комплект за генетична диагностика
2. Комплекти за екстракция на РНК и ДНК
3. Извличане на непротеинови компоненти от тъкани, разграждане на протеинови примеси, като ДНКваксини и подготовка на хепарин
4. Приготвяне на хромозомна ДНК чрез импулсна електрофореза
5. Western blot
6. Ензимни гликозилиран албумин реагенти in vitro диагностика
Предпазни мерки
Носете защитни ръкавици и очила, когато използвате или претегляте, и дръжте добре проветрен след употреба.Този продукт може да причини кожна алергична реакция и сериозно дразнене на очите.При вдишване може да причини симптоми на алергия или астма или диспнея.Може да причини дразнене на дихателните пътища.
Дефиниция на единица
Една единица (U) се определя като количеството ензим, необходимо за хидролизиране на казеина, за да се получи 1 μmolтирозин на минута при следните условия.
Приготвяне на реактиви
Реагент I: 1 g млечен казеин се разтваря в 50 ml 0,1 М разтвор на натриев фосфат (рН 8,0), инкубира се във вода при 65-70 ℃ за 15 минути, разбърква се и се разтваря, охлажда се с вода, регулира се с натриев хидроксид до pH 8,0 и се фиксира обемът 100 мл.
Реактив II: 0,1 М трихлороцетна киселина, 0,2 М натриев ацетат, 0,3 М оцетна киселина.
Реагент III: 0.4M Na2CO3решение.
Реагент IV: Форинт реактив, разреден с чиста вода 5 пъти.
Реагент V: Ензимен разредител: 0,1 М разтвор на натриев фосфат (рН 8,0).
Реагент VI: разтвор на тирозин: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml тирозин, разтворен с 0,2М НС1.
Процедура
1. 0,5 ml реагент I се затопля предварително до 37 ℃, добавят се 0,5 ml ензимен разтвор, разбърква се добре и се инкубира при37 ℃ за 10 минути.
2. Добавете 1 ml от реагент II, за да спрете реакцията, разбъркайте добре и продължете инкубацията за 30 минути.
3. Центрофугирайте реакционния разтвор.
4. Вземете 0,5 ml супернатант, добавете 2,5 ml реагент III, 0,5 ml реагент IV, разбъркайте добре и инкубирайте при 37 ℃за 30мин.
5. OD660е определена като ОД1;празна контролна група: 0,5 ml реагент V се използва за заместване на ензимаразтвор за определяне на OD660като OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Стандартна крива на L-тирозин: 0,5 ml разтвор на L-тирозин с различна концентрация, 2,5 ml реагент III, 0,5 ml реагент IV в 5 ml центрофужна епруветка, инкубирайте при 37 ℃ за 30 минути, детектирайте за OD660за различна концентрация на L-тирозин, след което се получава стандартната крива Y=kX+b, където Y е концентрацията на L-тирозин, X е OD600.
Изчисляване
2: Общ обем на реакционния разтвор (mL)
0,5: Обем на ензимния разтвор (mL)
0,5: Обем на реакционната течност, използван при хромогенно определяне (mL)
10: Време за реакция (мин)
Df: Многократно разреждане
C: Ензимна концентрация (mg/mL)
Препратки
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77 ч.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Рез.Общ.(1971);44:513.
3. Хилц, Х.и др.,Евро.J. Biochem.(1975);56:103-108.
4. Самбрук Джet ал., Молекулярно клониране: Лабораторен наръчник, 2-ро издание, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Фигури
Фиг.1 Оптимално pH
100 mM буферен разтвор: рН 6.0-8.0, Na-фосфат;pH 8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH. Ензимна концентрация: 1 mg/mL
Фиг.2 Оптимална температура
Реакция в 20 тМ К-фосфатен буфер рН 8.0.Ензимна концентрация: 1 mg/mL
Фиг.3 pH Стабилност
25 ℃, 16 h-третиране с 50 mM буферен разтвор: pH 4,5- 5,5, ацетат;pH 6.0-8.0, Na-фосфат;pH 8.0-9.0, Трис-НС1.рН 9.0-12.5, глицин-NaOH.Ензимна концентрация: 1 mg/mL
Фиг.4 Термичен стабилност
30 min-третиране с 50 mM Tris-HCl буфер, рН 8.0.Ензимна концентрация: 1 mg/mL
Фиг.5 Съхранение stability at 25 ℃
